不同比赛途程伊犁马赛后血浆代谢组分析.pdf

动物营养学报，（）：不同比赛途程伊犁马赛后血浆代谢组分析王建文，姚新奎，曾亚琦，王川坤 任万路 马超鑫 孟 军，（新疆农业大学动物科学学院，马产业研究院，乌鲁木齐；新疆马繁育与运动生理重点实验室，乌鲁木齐）摘 要：本研究旨在利用非靶向代谢组学技术筛选伊犁马不同速度赛比赛途程赛后血浆差异代谢物。选择参加伊犁马常态化赛事 和 年度比赛中成绩最佳的伊犁马各 匹，在比赛结束后 内采集颈静脉血并制备血浆，基于液质联用（）技术进行非靶向代谢组检测，筛选伊犁马不同比赛距离后差异代谢物并进行通路富集分析。结果表明：与 组血浆检测结果相比，组血浆中共筛选到 种差异代谢物，其中 种差异代谢物含量显著上调（），种差异代谢物含量显著下调（）；差异代谢物显著富集到泛醌等萜醌生物合成途径等代谢通路，在该代谢通路中差异代谢物反式肉桂酸和 酪氨酸含量下调。由此可见，比赛马匹血浆中苏氨酸和 赖氨酸含量较高，而 比赛马匹血浆中 乙酰左旋赖氨酸含量较高，利用代谢组学能够指导伊犁马不同途程的专项调教训练方案制定、赛后疲劳恢复及优秀马匹选择。关键词：代谢组学；伊犁马；比赛距离；血浆；速度赛中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（）；自治区创新环境（人才、基地）建设专项（）；新疆维吾尔自治区重大科技专项（）作者简介：王建文（），男，湖北天门人，副教授，博士，马业科学专业。：通信作者：孟 军，副教授，博士生导师，：运动对代谢途径的影响已在人类和动物模型中得到广泛研究。马匹在比赛过程中，由于运动强度较大，使得肌肉运动强度及持续时间均较平时会有所提升，能量消耗也会急剧上升，马匹将会面临较高的代谢压力。在比赛后，由于经过剧烈运动，马匹代谢物将会发生变化，导致马机体内的环境也发生改变，将会引起运动疲劳等现象发生，如果不能得到有效恢复，将会面临一定的运动损伤风险。在耐力赛马中，有 的参赛马匹会因为各种健康状况而被淘汰。因此，研究不同比赛途程马匹代谢组差异，将有助于更好地了解赛马运动生理机能，并根据比赛距离制定专项训练、赛后恢复及健康养殖与营养调控方案，降低马匹运动损伤风险，提高赛马福利。以往研究结果显示，运动必然会消耗营养和能量，提高新陈代谢，产生更多代谢产物，内源性代谢产物含量也会发生变化，引起生物体液（如血液、尿液、唾液等）代谢发生改变。代谢物变化会受到运动量、持续时间、运动强度等因素的影响，纯血马剧烈运动增加了糖酵解途径中的许多代谢物。当马匹比赛距离过长或比赛强度过高时，其能量消耗将会超过机体负荷，从而打破机体内的代谢动态平衡，严重时将可能影响到赛马健康及比赛寿命。代谢组分析是一种用于代谢物综合分析的方法，在体育科学领域已得到普遍应用。开展运动马代谢组学研究，区别不同运动类型、力量、强度下代谢物变化，识别与运动相关的代谢组学特征，能更好理解比赛过程中的能量来源，进一步识别出与运动表现、疲劳等相关的标志物。目前，关于不同比赛强度马匹代谢通路变化的报道 期王建文等：不同比赛途程伊犁马赛后血浆代谢组分析较少，伊犁马是我国自主培育的优秀运动马品种，其比赛性能在国产马中处于领先水平，但关于其运动生理机制还尚不完全清楚。因此，本研究以参加不同比赛距离为切入点，利用代谢组学技术，在不同比赛途程中筛选差异代谢物，旨在比较不同比赛途程马匹赛后代谢组差异，探索使用代谢组学评估和监测比赛强度的可行性，为不同比赛途程伊犁马专项训练方案制定及提高赛马福利提供技术参考。材料与方法 试验方法 本研究以 年 月每周末进行的伊犁马常态化赛事 和 速度赛马匹为研究对象，每周比赛获奖马匹参加当月底举行的月度赛，月度赛获奖马匹参加季度赛，季度赛获奖马匹参加年度决赛。在每场比赛结束后 内采集马匹颈静脉血液样本，并离心获得血浆，将获得的血浆置于 中保存待用。在年底决赛结束后，挑选全年比赛所有场次中成绩最好的马匹比赛后血液作为本次研究的样本，其中 组和 组各 匹。所选马匹之间无亲缘关系，所有马匹均为公马，年龄 岁。所有比赛在同一沙地环形跑道进行，跑道长 。液相色谱串联质谱（）分析 通过有机试剂沉淀蛋白法对样本进行代谢物提取，通过液相色谱串联质谱进行非靶向代谢组检测。色谱条件为：样品使用（）色谱柱进行分离，柱温为 ，流速为 。正离子模式下采用的流动相为 相：甲酸；负离子模式下采用的流动相为 相：醋酸铵（），流动相 相均为甲醇；洗脱梯度为 ，；，；，。质谱条件为：扫描范围选择质荷比（）；电喷雾电离源的设置如下：喷雾电压为 ；鞘气流速为；辅助气流速为 ；离子传输管温度为 ；辅助气加热器温度为 。数据统计分析 下机原始数据使用 软件，根据保留时间、质荷比等参数进行数据预处理，通过进行分子离子峰和碎片离子进行分子式预测，并与、和 数据库进行比对，用空白样本去除背景离子，并对原始定量结果进行标准化处理，计算相对定量结果。使用、和 数据库对鉴定到的代谢物进行注释。使用 软件对数据进行主成分分析（）和偏最小二乘法判别分析（），得到变量重要性投影（）值，并计算 组代谢物差异倍数（）值，以，且 或 为标准进行组间差异代谢物的筛选。使用 数据库进行代谢途径富集，当 时，认为该代谢途径富集；当代谢途径的 时，认为该代谢途径是显著富集。结 果 差异代谢物 为了验证组内样本的重复性，对检测结果进行，结果如图 所示，其主成分（）可以解释原始数据集的 特征，主成分（）可以解释原始数据集的 特征，主成分（）可以解释原始数据集的 特征。差异代谢离子的 识别出的散点聚集，离散性较好，代表相似性好。结果中 组样本组间分离明显，表明组间代谢物发生了明显变化。差异代谢物 结 果 如 图 所 示，组 和 组的主成分模式分离显著，无重叠现象。通过分析血浆差异代谢物获得的 为（图 中左图所示），表明该模型能够反映 组马匹之间 的差异；对该模型参数 和 进行置换检验，结果显示（图 中右图所示）差异代谢物的 值均高于 值，且 与 轴的截距小于，说明样本数据描述良好，没有过拟合现象，组样品检测结果间存在差异。差异代谢物分析 本研究中共注释到 种代谢产物，根据多变量统计分析 获得的变量重要性 值，结合单变量分析 和 检验结果，按照变量重要性，且 或 为标准进行差异代谢物筛选，组马匹血浆样本间共筛选出 种差异代谢物。由表 可知，与 比赛马匹血浆检测结果相比，比赛马匹血浆检测结果中含量上调的差异代谢物有 种，含量动 物 营 养 学 报 卷下调的差异代谢物有 种，表明这些差异代谢物可能受到马匹运动途程的影响，是不同途程赛马赛后进行监测的可能指标。这些差异代谢物主要为氨基酸、甘油磷脂类、糖类和有机酸类等及其衍生物，其中与 组血浆检测结果相比，组血浆中氨基酸及其衍生物（甲基谷氨酸、乙酰左旋赖氨酸）、甘油磷脂类及其衍生物血溶性磷脂胆碱（）、血溶性磷脂胆碱（）、血溶性磷脂胆碱（）、血溶性磷脂胆碱（）、酮基胆固醇、血溶性磷脂胆碱（）、糖类及其衍生物（葡萄糖磷酸二钠盐、核糖磷酸盐）、有机酸类及其衍生物（曲酸）及核苷类（尿苷、黄嘌呤核苷、尿嘧啶）、芳香类（喹啉）等代谢产物显著上调（），进一步揭示这些物质机体内合成增多或利用减少。火山图中每个点代表 个代谢物，显著上调的代谢物用红色点表示，显著下调的代谢物用绿色点表示，圆点大小代表 值，横轴表示 值，纵轴表示该组对比各物质的倍数变化，如图 所示。为 组，为 组。下图同。；图 血浆代谢物主成分分析 左图中 代表该模型解释率；代表该模型预测能力；右图中、代表运用偏最小二乘回归方法建立模型的评价参数，代表 与 的相关性。；，图 血浆代谢物偏最小二乘法判别分析 期王建文等：不同比赛途程伊犁马赛后血浆代谢组分析：值；：变量重要性投影 ；：上调 ；：下调 ；：无 差 异 ；：差异倍数。灰色代表无显著差异的代谢物，红色代表上调代谢物，绿色代表下调代谢物，图中点的大小代表 值。，图 差异代谢物火山图 对获得的 组差异代谢物进行层次聚类分析，得出同一比较对 组之间和组内代谢表达模式的差异情况（图）。各组样品可以很好地聚集在一起，并且具有相似代谢变化的代谢物聚集在同一簇，表明组间代谢物相对定量值层次聚类区分明显。差异代谢物通路富集分析 为研究差异代谢物所涉及的代谢途径和代谢物之间的关联性，对筛选出的 种具有显著差异性的代谢物进行通路富集分析，结果如表 所示，上述差异代谢物显著富集到泛醌等萜醌生物合成途径，表明该代谢通路可能是调节伊犁马运动的关键通路，在该代谢通路中差异代谢物反式肉桂酸和 酪氨酸下调；主要涉及到通路还包括矿物质吸收、氨酰 的生物合成、代谢途径、苯丙氨酸代谢和初级胆汁酸合成等途径。根据富集结果，选取 值由小到大排序前 的通路绘制气泡图（图）。表 差异代谢物分布 差异代谢物质荷比 保留时间 变量重要性投影值 值差异倍数值 上调 下调 甲基谷氨酸 （）硫辛酸（）甲硫氨酸 天冬氨酰苯丙氨酸甲基酯 苯丙氨酸 乙基苯甲醛 谷氨酰亮氨酸 乙酰葡糖胺磷酸（）苄基吡咯烷基，苯并噻唑（），腺苷酰硫酸，二羟基苯丙酸，酪氨酸 羟基苯甲醛 动 物 营 养 学 报 卷续表 差异代谢物质荷比 保留时间 变量重要性投影值 值差异倍数值 上调 下调 反式肉桂酸 苏氨酸 咪唑乳酸 赖氨酸 甲基哌啶 天冬酰胺 维生素 （，二羟基苯基）甲基丙氨酸（，）甲氯环素 乙酰左旋赖氨酸 苄基甲酰胺 三（羧乙基）膦（）血溶性磷脂胆碱（）（）血溶性磷脂胆碱（）（）牛磺酸 甲基乙内酰脲 肌酸 羟基，二甲基喹啉羧酸，谷氨酰酪氨酸 噻吩基噌啉羧酸（）葡萄糖磷酸二钠盐 甲基吲哚 曲酸 血溶性磷脂胆碱（）（）血溶性磷脂胆碱（）（）吲哚乙酸 原亮氨酸 核糖磷酸盐 酮基胆固醇 黄豆黄苷 羟基甲氧基苯乙胺乙二醇硫酸盐 期王建文等：不同比赛途程伊犁马赛后血浆代谢组分析续表 差异代谢物质荷比 保留时间 变量重要性投影值 值差异倍数值 上调 下调 尿苷 喹啉 血溶性磷脂胆碱（）（）黄嘌呤核苷 尿嘧啶 羟基吲哚 牛胆酸钠 羟基色氨酸 ，双（羟基苯基）甲氧基庚酮，（）变量重要性投影值由 模型计算得出。差异倍数值根据 组代谢物平均值相对于 组代谢物平均值的比率计算得出。表中代表含量上调，代表含量下调。表 同。，图 差异代谢物聚类热图 讨 论 代谢物的变化反映了机体对遗传、转录组、蛋白组及环境等各种因素影响下的生物学反应，相关技术已广泛应用于描述动物由于各种因素变化而产生的代谢模式，并发现了一系列与动物疾病和健康相关的生物标记物，因此，代谢生物标记物的筛选被认为是改善动物健康与福利的有效技术方法。动 物 营 养 学 报 卷 ：值；：代谢途径；：苯丙氨酸代谢；：氨酰 的生物合成；：泛醌等萜醌生物合成；：酪氨酸代谢；：牛磺酸和亚牛磺酸代谢；：嘧啶代谢；：蛋白质消化与吸收；：初级胆汁酸合成；，：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；：矿物质吸收；：精氨酸和脯氨酸代谢；：氧代羧酸代谢；：维生素 代谢；：硫胺素代谢；：赖氨酸降解；：胆固醇代谢；：咖啡因代谢；：丙氨酸代谢；：抗逆转录病毒抗体。图 差异代谢物 通路富集分析 表 代谢通路及相关差异代谢物 序号代谢途径 差异代谢物 值泛醌等萜醌生物合成反式肉桂酸；酪氨酸 矿物质吸收甲硫氨酸；苯丙氨酸 氨酰 的生物合成甲硫氨酸；苯丙氨酸；酪氨酸 代谢途径尿嘧啶；甲硫氨酸；黄嘌呤核苷；肌酸；甲基乙内酰脲；甲基哌啶；苯丙氨酸；牛磺酸；羟基苯甲醛；反式肉桂酸；酪氨酸；牛胆酸钠；吲哚乙酸；维生素；尿苷 苯丙氨酸代谢苯丙氨酸；反式肉桂酸；酪氨酸 初级胆汁酸合成牛磺酸；牛胆酸钠 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成苯丙氨酸；酪氨酸 嘧啶代谢尿嘧啶；尿苷 精氨酸和脯氨酸代谢肌酸；甲基乙内酰脲 牛磺酸和亚牛磺酸代谢牛磺酸；牛胆酸钠 咖啡因代谢黄嘌呤核苷 维生素 代谢维生素 氧代羧酸代谢甲硫氨酸；苯丙氨酸 期王建文等：不同比赛途程伊犁马赛后血浆代谢组分析续表 序号代谢途径 差异代谢物 值蛋白质消化与吸收甲硫氨酸；苯丙氨酸 酪氨酸代谢，二羟基苯丙酸；酪氨酸 赖氨酸降解甲基哌啶 硫胺素代谢酪氨酸 抗逆转录病毒抗体甲硫氨酸 胆固醇代谢牛胆酸钠 丙氨酸代谢尿嘧啶 马匹运动能力