阿维菌素致鸽子大脑组织程序性坏死研究_闫立地.pdf

2023(15):123-128,140特种动物研究 收稿日期:2022-11-18;修回日期:2023-03-01基金项目:黑 龙 江 省 自 然 科 学 基 金 联 合 引 导 项 目(LH2019C071)作者简介:闫立地(1983),女,讲师,硕士,研究方向为药理学,yanlidi830104 .DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.11.0197 阿维菌素致鸽子大脑组织程序性坏死研究闫立地1,邱思元1,王雨欣1,刘 畅1,翟祖欢1,杨 攀2,曲丽娜1,张奕婷1(1.大庆师范学院 生物工程学院,黑龙江 大庆 163712;2.贵州医科大学 基础医学院,贵阳 550025)中图分类号:S836;S859.83文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2023)15-0123-07摘 要:为了研究阿维菌素(AVM)对白羽王鸽大脑组织中细胞程序性坏死的影响,试验将 50 只 34 月龄白羽王鸽随机分成 5 组,分别为空白组(饲喂基础日粮)、30L 组(日粮中添加 20 mg/kg AVM,饲喂 30 d)、30H 组(日粮中添加 60 mg/kg AVM,饲喂 30 d)、60L 组(日粮中添加 20 mg/kg AVM,饲喂 60 d)、60H 组(日粮中添加 60 mg/kg AVM,饲喂 60 d),每组 10 只,剖杀取大脑组织后通过光学显微镜观察脑组织细胞形态并检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,通过实时荧光定量 PCR(qPCR)和 Western-bolt 方法分别检测程序性坏死相关基因肿瘤坏死因子-(TNF-)、受体相互作用蛋白激酶 1(RIPK-1)、受体相互作用蛋白激酶 3(RIPK-3)和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(MLKL)的 mRNA 和蛋白质表达情况。结果表明:与空白组比较,30H 组SOD、CAT 活性显著降低(P0.05);60L 组 SOD 活性显著降低(P0.05),CAT 活性极显著降低(P0.01),MDA 含量显著升高(P0.05);60H 组 SOD、CAT 活性极显著降低(P0.01),MDA 含量极显著升高(P0.01)。与空白组比较,60L 组 TNF-、RIPK-1、MLKL 的 mRNA 表达量显著升高(P0.05),RIPK-3 的 mRNA 表达量极显著升高(P0.01);60H 组 TNF-、RIPK-3、MLKL 的 mRNA 表达量极显著升高(P0.01),RIPK-1 的 mRNA 表达量显著升高(P0.05)。与空白组比较,60L 组RIPK-1、RIPK-3、MLKL 蛋白表达量显著升高(P0.05),TNF-蛋白表达量极显著升高(P0.01);60H 组 TNF-、RIPK-1、RIPK-3 蛋白表达量极显著升高(P0.01),MLKL 蛋白表达量显著升高(P0.05)。说明 AVM 可导致白羽王鸽脑组织发生程序性坏死。关键词:阿维菌素;白羽王鸽;脑组织;程序性坏死;氧化应激 开放科学(资源服务)标识码Open Science Identity(OSID)阿维菌素(avermectin,AVM)是一种广谱高效的驱虫药,1979 年由美国、日本科学家从土壤样品中分离得到。AVM 可用于农业杀虫,也可用于驱除、杀灭家畜、家禽体内和体外寄生虫,是我国应用最广泛的农畜两用杀虫剂1。然而随着 AVM 的大量使用,其在环境中的蓄积日益增加,严重污染生态环境2。近年来研究发现,AVM 对许多非靶向生物包括人类的神经系统、生殖系统和代谢系统等均有毒害作用,神经系统是主要的靶部位之一,并且至今尚无特效的AVM 中毒解救药物3-4。程序性坏死(necroptosis,Nec)是区别于凋亡和自噬的第三种死亡方式5。程序性坏死受多种基因的调控,如肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、受 体 相 互 作 用 蛋 白 激 酶 1(receptor-interacting protein1,RIPK-1)、受体相互作用蛋白激酶 3(RIPK-3)、混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domainlike protein,MLKL)等6-7。RIPK-3 的结构改变又会诱导产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),进一步加重疾病8-9。大量研究结果表明,细胞程序性坏死对脑部神经元破坏性极大,是帕金森、阿尔茨海默病等神经退行性疾病发生的重要诱因10-11。国内外有关 AVM 的研究主要集中在水生生物、无脊椎动物和哺乳动物方面,关于其对鸟类的毒理研究少见。鸟类中的白羽王鸽是一种对环境极其敏感的生物,被认为是环境污染的指向标,但有关 AVM对鸽子程序性坏死方面的研究非常少12。本试验以白羽王鸽为研究对象,建立王鸽 AVM 慢性中毒模型,探讨 AVM 对王鸽大脑组织程序性坏死的影响,3212023(15):123-128,140特种动物研究以期为评价环境中 AVM 蓄积对鸟类神经系统的毒性效应提供理论基础,也为合理使用 AVM 提供科学依据。1 材料1.1 试验动物及日粮34 月龄健康的白羽王鸽 50 只,雌雄各半,购自大庆市林甸县庆缘动物养殖场。鸽子基础日粮(组成及营养水平见表 1),购自天津升华鸽粮有限公司。表 1 基础日粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient level(dry matter basis)of basal diet项目含量项目含量日粮组成营养水平 玉米/%50.0 代谢能/(MJ kg-1)12.24 小麦/%17.0 粗蛋白/%15.87 豌豆/%16.0 钙/%1.21 豆粕/%13.0 赖氨酸/%0.89 磷酸氢钙/%2.5 蛋氨酸/%0.25 贝壳粉/%1.0 磷/%0.67 食盐/%0.5 注:代谢能为计算值,其余营养指标为实测值。1.2 药品与主要试剂阿维菌素(含量为 98%),购自大庆志飞生物化工有限公司;丙酮(分析纯),购自天津市科密欧化学试 剂 有 限 公 司;超 氧 化 物 歧 化 酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所;BCA 蛋白浓度测定试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;反转录试剂盒,购自罗氏公司;蛋白裂解液,购 自Apexbio 公司;-actin 抗体、TNF-、RIPK-1、RIPK-3、MLKL、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(二抗),均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。1.3 主要仪器低温离心机(型号为 3-30KS),购自德国 Sigma公司;酶标仪(型号为 Multiskan FC),购 自 美 国Thermo Fisher Scientific 公司;核酸蛋白检测仪(型号为 BioPhotometer plus),购自德国艾本德公司;实时荧光定量 PCR 仪(型号为 ABI7500),购自美国 Applied Biosystems 公司;垂直电泳槽(型号为 165-8001),购自美国 Bio-Rad 公司;数码凝胶/化学发光图像分析系统(型号为 4600SF),购自上海天能科技有限公司;电动研磨器(型号为 MY-20),购自上海净信实业发展有限公司。2 方法2.1 AVM 染毒鸽粮的配制以丙酮为溶剂,在黑暗条件下按照 AVM 丙酮=60 mg 10 mL 的 比 例 配 制 染 毒 母 液。按 照60 mg/kg AVM 的剂量对日粮喷施 AVM 母液,黑暗条件下自然干燥 15 min,待丙酮挥发,AVM 可黏附于日粮表面,制作成含量为 60 mg/kg 的染毒日粮,即高剂量染毒鸽粮。干燥后,将高剂量染毒日粮与基础日粮按照12比例混合,制作成含量为20 mg/kg 的染毒日粮,即低剂量染毒鸽粮13。2.2 试验动物分组与饲养将 50 只白羽王鸽随机分成 5 组,每组 10 只。第一组为空白组,饲喂基础日粮;第二组为30L 组,连续饲喂低剂量染毒鸽粮 30 d;第三组为 30H 组,饲喂高剂量染毒鸽粮 30 d;第四组为 60L 组,饲喂低剂量染毒鸽粮 60 d;第五组为 60H 组,饲喂高剂量染毒鸽粮60 d。试验鸽自由采食和饮水,严格按照白羽王鸽的饲养管理标准以层叠式笼养方式进行饲养。2.3 样品的采集与处理空白组和 30L 组、30H 组第 30 天剖杀,60L 组和60H 组第 60 天剖杀。利用颈静脉放血法处死白羽王鸽,迅速断头,取出大脑组织,切取 1.0 mm1.0 mm5.0 mm 大小的组织,固定于 10%多聚甲醛溶液中,4 保存,用于形态学观察;分别取大脑组织 100 mg,放入 1.5 mL 离心管中,将离心管放入液氮速冻,采样结束后放入-70 冰箱中冻存,用于实时荧光定量PCR(qPCR)检测和 Western-blot 检测。2.4 H.E.染色观察脑组织形态将固定于 10%多聚甲醛溶液中的样品常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切片(切片厚度为5 m),进行 H.E.染色,观察王鸽大脑组织的病理形态。2.5 脑组织氧化应激水平的检测取出冷冻的装有脑组织的离心管放于冰上,按照质量(g)体积(mL)=1 7的比例加入预冷的生理盐水,用 预 冷 的 电 动 研 磨 器 充 分 研 磨 后,4、3 000 r/min 离心 10 min,取上清液于 1.5 mL 离心管中待测。按照相应试剂盒说明书检测大脑组织SOD、CAT 活性和 MDA 含量。2.6 程序性坏死相关基因 mRNA 表达的检测取王鸽大脑组织 100 mg 放入预冷的研钵中,加入液氮研磨至糊状,而后加入裂解液 1 mL,利用TRIzol 法提取总 RNA。通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性,采用核酸蛋白检测仪测定 RNA 浓度,按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA。以 cDNA为模板,通过 qPCR 检测目的基因 TNF-、RIPK-1、RIPK-3 和 MLKL 的 mRNA 表达情况,以 GAPDH 基因作为内参基因。扩增体系(总体积为 10 L):2miRcute Plus miRNA Premix 5 L,上下游引物各0.2 L,cDNA 模板 1 L,RNase-free 双蒸水 3.6 L。扩增程序:95 预变性 15 min;94 变性 20 s,60 4212023(15):123-128,140特种动物研究退火 34 s,40 个循环。每个样品做 3 个重复。引物序列信息见表 2,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用 2-Ct法计算各基因 mRNA 相对表达量。表 2 qPCR 引物序列信息Table 2 Sequence information on qPCR primers基因 引物序列TNF-F 5-TACCCTGTCCCACAACCTGG-3R 5-CGGGTTGCTGCACATACACA-3RIPK-1F 5-CCATCTTCAACCAGCGCCAT-3R 5-CCTGTATCCGTGTCTGCTGC-3RIPK-3F 5-GTCCCCGTTCCTGTGTACCA-3R 5-ATTCGGATTTGCTCTTCCTCTGT-3MLKLF 5-AATGCTGACCAAGCTGCTCC-3R 5-TCCTCCAGGCTCCTGTTCAC-3GAPDHF 5-TGTCAAGGCTGAGAACGGGA-3R 5-GCACCTGCATCTGCCCATTT-32.7 Western-blot 检测程序性坏死相关蛋白的表达在冻存的大脑组织中加入含 PMS 的裂解液,用预冷的电动研磨器研磨 1 min;冰上裂解 30 min;4、12 000 r/min 离心 10 min;收集上清