TGXAS 408-2022 农杆菌介导甘蔗遗传转化技术规程.pdf

ICS 65.020.20 CCS GXAS B 30 团体标准 T/GXAS 4082022 农杆菌介导甘蔗遗传转化技术规程 Technical code of pratice for agrobacterium-mediated genetic transformation of sugarcane 2022-12-13 发布 2022-12-19 实施 广西标准化协会 发 布 全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/GXAS 4082022 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 设备和用具.1 5 试剂.1 6 培养基.2 7 无菌苗培养.2 8 农杆菌液准备.3 9 遗传转化.3 10 转基因苗移栽.4 11 目的基因检测.4 全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/GXAS 4082022 II 前言 本文件参照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业科学院提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院、中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所、广西甘蔗学会、农业部甘蔗生物技术遗传改良重点实验室。本文件主要起草人：秦翠鲜、黄东亮、廖芬、陈忠良、汪淼、潘有强、李傲梅、周丽、陈颜、黄甜梅。全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/GXAS 4082022 1 农杆菌介导甘蔗遗传转化技术规程 1 范围 本文件确立了农杆菌介导甘蔗遗传转化的程序，界定了农杆菌介导甘蔗遗传转化技术所涉及的术语和定义，规定了设备、用具、试剂、培养基的要求，以及无菌苗培养、农杆菌液准备、遗传转化、转基因苗移栽、目的基因检测等阶段的操作指示。本文件适用于农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化的操作。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 农杆菌介导 agrobacterium-mediated transformation 在农杆菌侵染植物细胞的过程中将外源基因整合到农杆菌Ti质粒上的一段T-DNA，随后携带外源基因的T-DNA插入到受体植物基因组中，最后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的遗传转化方法。3.2 遗传转化 genetic transformation 利用重组DNA技术和细胞组织培养技术将外源基因导入植物基因组中使植物获得新性状的技术。4 设备和用具 4.1 设备 超净工作台、细菌培养箱、超低温冰箱(-80)、电热消毒器。4.2 用具 医用剪刀、医用镊子、医用手术刀、无菌滤纸、脱脂棉、培养瓶、离心管、培养皿。5 试剂 5.1 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。所有试剂溶液宜大体积（1 L）配制、小体积（10 mL100 mL）分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂通过 0.22 um 滤膜过滤除菌。5.2 试剂：硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、蔗糖、琼脂、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、利福平（Rif）、乙酰丁香酮（AS）、葡萄糖、果糖、牛肉浸膏、胰蛋白胨、酵母浸膏、头孢霉素（Cef）。全国团体标准信息平台T/GXAS 4082022 2 6 培养基 6.1 MS(Murashige and Skoog)培养基 成分为：硝酸铵1.65 g；硝酸钾1.9 g；磷酸二氢钾0.17 g；硫酸镁0.37 g；氯化钙0.44 g；碘化钾0.83 mg；硼酸6.2 mg；硫酸锰22.3 mg；硫酸锌8.6 mg；钼酸钠0.25 mg；硫酸铜0.025 mg；氯化钴0.025 mg；乙二胺四乙酸二钠37.3 mg；硫酸亚铁27.8 mg；肌醇100 mg；甘氨酸2 mg；盐酸硫胺素0.1 mg；盐酸吡哆醇0.5 mg；烟酸0.5 mg；蔗糖30 g；琼脂7 g；加蒸馏水定容至1 L。6.2 愈伤组织诱导培养基 成分为：MS培养基41.74 g/L，2,4-D 3.0 mg/L，pH=5.8。6.3 愈伤组织增殖培养基 成分为：MS培养基41.74 g/L，2,4-D 2.0 mg/L，pH=5.8。6.4 愈伤组织分化培养基 成分为：MS培养基41.74 g/L，6-BA 2.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L，pH=5.8。6.5 无菌苗增殖培养基 成分为：MS培养基41.74 g/L，6-BA 1.0 mg/L，NAA 0.05 mg/L，pH=5.8。6.6 生根培养基 成分为：MS培养基41.74 g/L，NAA 4.0 mg/L，pH=5.8。6.7 转化培养基 成分为：MS培养基20.87 g/L，2,4-D 1.0 mg/L，AS 200 mol/L，果糖10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，pH=5.3。6.8 YEP（Yeast Extract Peptone Broth Medium）培养基 成分为：牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蔗糖5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，pH=7.0。6.9 脱菌、筛选培养基 成分为：MS培养基41.74 g/L，NAA 4.0 mg/L，头孢霉素500 mg/L，根据构建的载体选择相应的筛选抗生素及浓度，pH=5.8。7 无菌苗培养 7.1 外植体准备、灭菌与诱导 7.1.1 外植体准备 于晴天9:0017:00选取处于生长中期的健康甘蔗蔗梢，剪掉叶片，留取30 cm40 cm长的蔗梢。7.1.2 灭菌 7.1.2.1 器具消毒 用电热消毒器将医用剪刀、医用镊子、医用手术刀等工具消毒，消毒后宜适当冷却至室温。7.1.2.2 蔗梢消毒 用75乙醇浸泡过的脱脂棉擦拭蔗梢，每擦一次剥掉一层叶鞘，待剥掉45层叶鞘后放入超净工作台内的无菌纸上。全国团体标准信息平台T/GXAS 4082022 3 7.1.3 愈伤组织诱导 在超净工作台继续剥离叶鞘直到幼嫩的心叶组织，取距离生长点10 cm左右的心叶组织放在无菌滤纸上，用医用手术刀把心叶组织切成0.2 mm的薄片。用医用镊子把薄片插入含愈伤组织诱导培养基的培养皿中，用封口膜把培养皿封好。把培养皿放入培养箱中，在26 28，24 h黑暗条件下培养，15 d20 d转接1次，直到获得胚性愈伤组织。7.2 增殖培养 每隔15 d20 d将胚性愈伤组织转接至新鲜的愈伤组织增殖培养基中增殖，直至愈伤组织呈现淡黄色、干燥致密的状态。7.3 分化培养 将生长状态良好的胚性愈伤组织在超净工作台上用镊子分成大小一致的小颗粒，转接至新鲜的愈伤组织分化培养基。把培养瓶放在温度为26 28 的培养室内，光照强度宜为1 500 Lx3 000 Lx，光照时间为16 h/d。待愈伤组织分化出绿色丛芽，丛芽长至2 cm3 cm高时，分成单株转接至无菌苗增殖培养基中增殖培养，待苗长至4 cm5 cm高时可以用于转化。8 农杆菌液准备 8.1 从-80 超低温冰箱取出 EHA105 农杆菌菌株，在含相应抗生素（根据构建的载体所带的抗性基因选择）和利福平的 YEP 培养基板上划线，于细菌培养箱 28 条件下培养 48 h。8.2 挑取单菌落接种到 10 mL 含相应抗生素（根据构建的载体所带的抗性基因选择）和利福平的 YEP液体培养基中，温度为 28，200 rpm 振荡培养至 OD600（吸光值，波长 600 nm）值为 0.8。8.3 取 1 mL 菌液放入 50 mL 含相应抗生素（根据构建的载体所带的抗性基因选择）和利福平的 YEP 液体培养基中，温度为 28，200 rpm 振荡培养至 OD600（吸光值，波长 600 nm）值为 0.50.6。8.4 将菌液转到离心管中，温度为 4，5 000 rpm 离心 5 min8 min，弃上清液，收集菌体。8.5 将菌体重悬于与8.3中YEP液体培养基等体积含200 mol/L AS的转化液体培养基中，温度为28，200 rpm 培养 2 h。9 遗传转化 9.1 选取转化材料 待幼苗长至4 cm5 cm时，选取健壮的甘蔗幼苗作为转化材料。9.2 材料处理 在超净工作台上用镊子分成单株，用医用剪刀从距离基部1 cm处剪去上面带叶子的部分，留取含生长点在内的小茎段。9.3 侵染 把6080个小茎段转至培养瓶中，加入50 mL农杆菌液，浸染8 min10 min，期间用手轻微晃动。9.4 共培养 侵染完成后用镊子取出，用无菌滤纸将菌液吸干转入无菌水中换水清洗23次，再用无菌纸吸干，转接到无抗生素的增殖培养基上，26 28，黑暗条件下共培养3 d5 d。9.5 脱菌、筛选培养 9.5.1 在温度为 26 28 的培养室内，光照强度宜为 1 500 Lx3 000 Lx，光照时间为 16 h/d 的条件下，将无菌苗转入含有 500 mg/L 头孢霉素和相应抗生素（根据构建的载体所带的抗性基因选择）的生根培养基中培养 35 d40 d。9.5.2 经过抗生素筛选，将获得相应抗性的转基因苗转至无抗生素的生根培养基上恢复培养 4 d。全国团体标准信息平台T/GXAS 4082022 4 10 转基因苗移栽 10.1 炼苗 打开瓶盖移至炼苗室，在温度为26 28，空气相对湿度为80，光照强度为1 500 Lx3 000 Lx，光周期为16 h光照，8 h黑暗条件下，炼苗2 d3 d。10.2 室内移栽 取出幼苗，用流水洗净附着的培养基，种植于育苗盆中，放在80空气相对湿度的温室中培养，待苗成活后分单株种植于装有营养土的盆中。11 目的基因检测 在组培苗进行筛选培养后，按GB/T 19495.7的规定对幼苗抽样，采用PCR检测方法对幼苗进行目标基因检测。待转化苗长出78片叶时取23片叶提取基因组DNA，对目的基因进行PCR扩增，扩增结果有目的基因条带的说明目的基因转入转化苗并表达成功。全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台 中华人民共和国团体标准 农杆菌介导甘蔗遗传转化技术规程T/GXAS 4082022 广西标准化协会统一印制 版权专有 侵权必究全国团体标准信息平台