基于转录组测序分析白藜芦醇促进山羊肌内脂肪沉积的机制_宋颖.pdf

3期681基于转录组测序分析白藜芦醇促进山羊肌内脂肪沉积的机制宋颖，张叁保，徐健健，邹剑伟，连子童，邹菊红，黄艳娜，蒋钦杨*（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004）摘要：【目的】基于转录组测序（RNA-Seq）分析白藜芦醇促进努比亚山羊肌内脂肪沉积的机制，以期找到白藜芦醇影响肌内脂肪沉积的候选基因及调控网络。【方法】采用转录组测序技术对饲料中添加600 mg/kg 白藜芦醇组山羊的背最长肌和对照组山羊的背最长肌进行分析。利用edgeR软件进行差异基因（Differentially expressed genes，DEGs）筛选 Fold Change2，错误发现率（FDR）0.05，并对DEGs进行GO功能注释和KEGG富集分析。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测P13K-AKT信号通路关键基因及脂肪分化标志基因的表达。【结果】600 mg/kg白藜芦醇组山羊肌内脂肪含量极显著高于对照组（P0.01，下同）。RNA-Seq结果显示共筛选出399个DEGs，包括328个上调基因及71个下调基因。DEGs共注释到48个条目，主要包括细胞过程、单有机体过程、细胞、绑定和催化活性。KEGG通路富集分析发现，DEGs主要富集到252个通路，主要包括P13K-AKT信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路等与脂肪代谢相关的通路，从中进一步筛选出可能参与肌内脂肪沉积的基因（IGFBP7和IRX3）。qRT-PCR结果显示，试验组山羊背最长肌P13K-AKT信号通路关键基因（P13K、AKT和MTOR）和脂肪分化标志基因（PPAR、FAS和CEBP）的表达量极显著高于对照组。50 mol/L RSV诱导肌细胞8 d后发现，脂滴极显著多于对照组，P13K、AKT、MTOR、PPAR、FAS和CEBP的表达量极显著高于对照组。【结论】基于RNA-Seq分析白藜芦醇促进努比亚山羊肌内脂肪沉积的机制，结合其诱导肌细胞成脂分化，猜测白藜芦醇可能通过P13K-AKT信号通路促进努比亚山羊肌内脂肪的沉积。关键词：转录组测序；白藜芦醇；山羊；肌内脂肪；P13K-AKT中图分类号：S827文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）03-0681-10收稿日期：2022-11-23基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1100100）；国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设项目（nycytxgxcxtd-2021-09）通讯作者：蒋钦杨（1981-），https：/orcid.org/0000-0002-0835-9347，博士，研究员，博士生导师，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作，E-mail：第一作者：宋颖（1995-），https：/orcid.org/0000-0001-8594-8228，研究方向为动物遗传育种，E-mail：Mechanism of resveratrol promoting intramuscular fat deposition in goats based on transcriptome sequencing analysisSONG Ying，ZHANG San-bao，XU Jian-jian，ZOU Jian-wei，LIAN Zi-tong，ZOU Ju-hong，HUANG Yan-na，JIANG Qin-yang*（College ofAnimal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）Abstract：【Objective】This study was mainly based on transcriptome sequencing（RNA-Seq）to analyze the mecha-nism of resveratrol promoting intramuscular fat deposition in Nubian goats，in order to find the candidate genes and regu-latory networks of resveratrol affecting intramuscular fat deposition.【Method】The longissimus dorsi muscle of goats inthe 600 mg/kg resveratrol group and the control group were analyzed by transcriptome sequencing technology.Differen-tially expressed genes（DEGs）screening Fold Change2，false discovery rate（FDR）0.05was performed using edgeRsoftware，and GO function annotation and KEGG enrichment analysis were performed on DEGs.Real-time fluorescencequantitative PCR（qRT-PCR）was used to detect the expression of P13K-AKT signaling pathway key genes and fat differen-tiation marker genes.【Result】The results showed that the intramuscular fat content of goats in the 600 mg/kg resveratrolgroup was extremely significantly higher than that in the control group（P0.01，the same below）.RNA-Seq resultsshowed that 399 differential genes were screened，including 328 up-regulated genes and 71 down-regulated genes.DEGswere annotated to a total of 48 entries，mainly including cellular processes，single-organism processes，cellular，binding，and catalytic activities.KEGG pathway enrichment analysis found that the DEGs were mainly enriched to 252 path-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：681-690ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.00454卷南 方 农 业 学 报 6820引言【研究意义】努比亚山羊原产于非洲，属于奶肉兼用型山羊品种，具有生长速度快、产肉量高、肉质细嫩等特点（张瑜等，2021）。肌内脂肪（Intramuscularfat，IMF）指位于骨骼肌纤维之间的脂肪组织，其主要成分是磷脂和甘油三酯（苏晓月等，2020）。研究发现，肌肉脂肪含量与肉色、嫩度和多汁性呈正相关，是评定肉质的重要指标（Picard et al.，2018；Liuet al.，2019），肌肉脂肪含量越高，肉质越好。因此，研究肌肉脂肪分子调控机制，对提高肌肉脂肪含量具有积极意义。【前人研究进展】影响肌内脂肪沉积的因素主要包括品种、性别、年龄及营养水平（马现永等，2010）。肌肉脂肪含量受肌内脂肪细胞大小和数量的影响，在细胞水平，影响肌肉脂肪含量的因素主要是前体脂肪细胞的增殖和分化（Hausman andDodson，2013；齐婧等，2022）。畜禽生长早期，主要是脂肪细胞的增殖，增殖到一定阶段后脂肪细胞开始分化（倪和民等，2020）。在脂肪细胞的分化过程中，主要受PPAR、C/EBP和ZNF423等转录因子的调控（Gregoire et al.，1998；Farmer，2006）。同时，FAS、ACC和LPL等与脂肪酸相关的酶活性也会影响肌肉脂肪含量（Lu et al.，2007）。调整日粮中营养物质可促进肌内前体脂肪细胞的增殖分化，增加甘油三脂含量（张翊慧等，2021）。白藜芦醇（反式3,4,5-三羟基二苯乙烯，RSV）是一种植物多酚，主要存在于植物皮和种子中，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用，对葡萄糖和脂质的稳态也具有一定的调节作用（Chaplin et al.，2018；Galiniak et al.，2019）。此外，RSV还能调节脂肪细胞的增殖、分化和凋亡，影响脂肪代谢（Ahn et al.，2011）。饲料中添加400 mg/kgRSV能激活SIRT1信号通路，降低促凋亡基因的表达（周婉婷等，2022）。RSV能激活PKA/AMPK/PPAR信号通路改善NAFLD中脂质代谢；激活猪皮下脂肪和肝脏中AdipoQ信号通路以促进脂肪代谢并抑制脂肪合成，降低皮下脂肪的厚度，增强肝脏脂质代谢（崔悦悦，2019；Huangg et al.，2020）。此外，RSV对肌内脂肪的沉积也有一定影响。研究发现，在育肥猪的日粮中添加白藜芦醇可提高背最长肌的肌内脂肪含量（Meng et al.，2020）。【本研究切入点】白藜芦醇作为一种饲料添加剂，在调控畜禽的脂质代谢方面已有相关研究，但关于白藜芦醇影响反刍动物肌内脂肪沉积的报道较少。【拟解决的关键问题】在努比亚山羊的饲料中添加600 mg/kg RSV，饲喂阉公山羊，正式试验期4个月，运用RNA-Seq技术研究RSV对育肥山羊肌内脂肪沉积的影响，以期筛选出DEGs，探究与肌内脂肪沉积相关的信号通路，为改善山羊的肉质提供理论基础。1材料与方法1.1试验材料选取20只健康的（1803）日龄、体重相近的去势努比亚公山羊，随机分为基础饲粮（对照，CK）和含RSV的饲粮组（600 mg/kg RSV+基础日粮），每组10个重复。根据预试验结果显示，肌肉脂肪含量对RSV呈剂量依赖效应，以600 mg/kg RSV的肌肉脂肪含量最高，故选定RSV的添加量为600 mg/kg。山羊的初始平均体重为28.250.26 kg，试验期120 d。试验期间，山羊自由采食，自由饮水。试验结束后，采集山羊背最长肌存放于-80 冰箱。小鼠C2C12成肌细胞存放于广西大学动物科学技术学院。TRIzol、TB Green premix Ex TaqTM、PrimeScriptTMRT rea-gent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自TaKaRa生物公司；异丙醇和氯仿均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；实时定量PCR仪（CFX96）购自美国BioRad；油红O染色液购自北京索莱宝科技有限公司。ways，mainly including P13K-AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，AMPK signaling pathway and otherpathways related to fat metabolism，from which genes that might be involved in intramuscular fat deposition（IGFBP7，IRX3）were further screened out.The results of qRT-PCR showed that the expression levels of P13K-AKT signaling path-way key ge