富硒饲粮对农药Diquat诱导的鸡心脏氧化应激和细胞凋亡的影响.pdf

动物营养学报，（）：富硒饲粮对农药 诱导的鸡心脏氧化应激和细胞凋亡的影响胡心宇 吴雅琳 刘 犇，郑文亚 杨 雪，胡 威 陈欠林 李指全 杨敩校 王小月（宜春学院生命科学与资源环境学院，宜春；江西省高等学校硒农业工程技术研究中心，宜春；宜春市农业农村局，宜春）摘 要：为探究饲粮加硒对 诱导的鸡心脏氧化应激和细胞凋亡率的影响，将同一批次（日龄）的健康且体重（）相近的康乐黄鸡 只随机分成 组，经适应性饲养 周后，、组饲喂基础饲粮，、组饲喂添加亚硒酸钠饲粮（硒），饲喂 后，、组腹腔注射 ，、组腹腔注释等量生理盐水，处理 后处死所有鸡，采取心脏组织，采用苏木精伊红（）染色方法观察心脏组织病理损伤情况，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 缺口末端标记测定法（）观察心脏细胞凋亡的情况，采用氧化指标试剂盒测定心脏抗氧化相关指标，采用 和实时荧光定量 方法在蛋白和基因水平上进行定量分析。结果表明：染色结果显示，与 组相比，组心肌纤维断裂明显，组织界限模糊不清，而 组断裂的心肌纤维数量明显减少。分析结果显示，组的心脏细胞凋亡率极显著高于 组（），组的心脏细胞凋亡率极显著低于 组（）。抗氧化测定指标结果显示，组心脏中的过氧化氢酶（）活性显著低于 组（），组的心脏 活性显著高于 组（），组心脏中丙二醛（）的含量显著高于 组（），组的心脏 含量极显著低于 组（）。结果显示，心脏的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（）和核转录因子（）蛋白表达量在 组间并无统计学差异（）。实时荧光定量 结果显示，与 组相比，组心脏中的 和 相对表达量显著升高（），组心脏中 和 的 相对表达量比 组显著下降（）。以上研究结果表明，能够成功诱导康乐黄鸡心脏发生氧化应激和细胞凋亡，而饲喂富硒饲粮鸡心脏的氧化应激和细胞凋亡率都能得到一定程度的改善。关键词：富硒饲粮；氧化应激；心脏；细胞凋亡中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：江西省教育厅科技项目（，）；宜春学院大学生创新创业训练项目（，）作者简介：胡心宇（），男，江西赣州人，本科生，从事动物疾病防治研究。：同等贡献作者 通信作者：刘 犇，副教授，：；郑文亚，副教授，：硒是家禽生长过程中不可或缺的微量矿物质元素之一，并且硒具有抗氧化、提高机体抗病力、增加家禽产蛋量以及提高家禽肉质中的蛋白质含量等多种功能。同时我国家禽饲粮以玉米豆粕型为主，难以满足家禽对硒的需要量。富硒饲粮作为近年热门的畜禽饲粮有很高的生物学效价和抗氧化性能，本项目把运用富硒饲粮提升禽类体内硒含量及提升机体抗氧化应激能力作为相动 物 营 养 学 报 卷关研究的主要内容。康乐黄鸡目前为赣西地区的主要养殖鸡种，因其耐粗饲、适应性广、抗病力强、易饲养的特点，且家禽的氧化系统和抗氧化系统的平衡是保持健康的重要因素，因此康乐黄鸡是一种研究氧化应激的良好模型。而生产上这种平衡往往会因为各种应激源的存在而被打破，这会导致过量自由基的积累，它们具有极强的氧化能力，可导致 的复制异常，同时引起细胞膜通透性的改变。一般机体在正常情况下，本身的抗氧化系统基本上可以清除体内产生的自由基以及由自由基引起的过氧化物。但是在很多时候，很多外因会造成体内自由基的大量增加，长时间受过量自由基的危害会影响机体对自由基的清除能力进而导致细胞氧化应激，所以随时清除体内的自由基，保持机体内环境的相对平衡是非常重要的。试验所用的氧化应激诱导剂（敌草快）是一种联吡啶类除草剂，在农业生产中非常常见，其可诱导机体发生氧化应激反应。氧化应激会对细胞造成损伤，为了维持稳定的状态和对各种刺激作出反应，相关基因会表达相关蛋白严格控制损伤细胞的死亡，这样的一个过程叫做细胞凋亡。这个过程受半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（）家族、核转录因子（）、泛素蛋白体系统和磷脂酰肌醇激酶（）途径等蛋白质的调控，本研究将利用其中 和 这 种蛋白探讨富硒饲粮改善细胞凋亡的情况。由于 的广泛应用，当今禽类养殖业广受氧化应激带来的影响，给养殖行业带来了巨大的经济损失。本研究拟探讨富硒饲粮对鸡心脏氧化应激和细胞凋亡率的改善作用，这对于减轻禽类氧化应激对心血管系统的损伤具有重要意义，也为研究富硒饲粮改善鸡氧化应激和细胞凋亡率相关研究的开展提供理论依据。材料与方法 试验设计 将购自江西省某鸡场同一批次（日龄）、体重为（）且健康的 只康乐黄鸡随机分成 组，每组 个重复，每个重复 只鸡，分别标记为、组。组为对照组（基础饲粮腹腔注射生理盐水），组为 诱导氧化应激组（基础饲粮腹腔注射），组为对硒拮抗 诱 导 氧 化 应 激 组 添 加 亚 硒 酸 钠 饲 粮（硒）腹腔注射，组为硒组添加亚硒酸钠饲粮（硒）腹腔注射生理盐水。经适应性饲养 周后，、组饲喂基础饲粮，、组饲喂添加亚硒酸钠饲粮，饲喂 后腹腔注射 生理盐水或 ，试验 结 束 时 将 组 鸡 全 部 处 死。正 式 试 验期 。主要试剂 、酶抑制剂购自宝生物工程有限公司，水饱和酚、醋酸钠购自生工生物工程股份有限公司，反转录试剂盒、试剂盒购自生物科技股份有限公司，牛血清白蛋白、缓冲盐溶液（）、含吐温 的 缓冲盐溶液（）、苏木精、伊红购自北京索莱宝科技有限公司，石蜡、中性树脂胶购自北京中杉金桥生物技术有限公司，总蛋白提取试剂盒、蛋白工作液购自北京普利莱基因技术有限公司，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（）凝 胶 制 备 试 剂 盒、蛋 白 预 染、发光液购自武汉博士德生物工程有限公司，、购自艾博抗贸易有限公司，过氧化氢酶（）、丙二醛（）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。样品采集 各组鸡经颈动脉放血致死后，利用经高压灭菌的解剖刀、解剖剪和解剖镊等无菌器械采集心脏组织，然后用预冷的磷酸缓冲盐溶液（）冲洗干净后将心脏组织分成 部分，一部分修整成 左右大小的组织块，放入到事先配制好的 多聚甲醛溶液中进行固定，用于后续的组织学试验；另一部分用刀片切成小块，分成 份，分别放入到 个无菌无 酶的冻存管中，迅速放入到液氮中速冻，然后再转移到 冰箱中保存，分别用于提取组织总 和总蛋白。组织切片及苏木精伊红（）染色 将前期经 多聚甲醛溶液固定好的心脏组织经缓水流冲洗 去除固定液，上行梯度乙醇 期胡心宇等：富硒饲粮对农药 诱导的鸡心脏氧化应激和细胞凋亡的影响脱水，在二甲苯和乙醇混合液中处理 ，随后放入二甲苯进行透明，处理好后开始梯度浸蜡，浸蜡结束后用提前制好的混合蜡填充组织包埋框，将组织夹入其中制作成石蜡组织包埋块，包埋好的石蜡块用切片机切成厚度为 切片，后将制好的切片进行 染色并封片观察。脱 氧 尿 嘧 啶（）缺 口 末 端 标 记 法（）检测细胞凋亡 将 多聚甲醛溶液固定的心脏样本在石蜡包埋切片（）后，按照末端脱氧核苷酸转移酶介导的 测定试剂盒的说明操作，通过 检测细胞凋亡。将心脏组织切片脱蜡，再水化，用蛋白酶 溶液在 下孵育 。洗涤 次（每次 ），每张切片滴加 反应混合物（酶液与标记液 混合）在 下孵育 。随后再次洗涤 次，与抗荧光素抗体，绵羊 片段，与辣根过氧化物酶（）偶联孵育，后，用 冲洗切片，并对每张切片滴加 底物，室温（约 ）下反应 。最后对切片进行苏木精复染，脱水透明后装片。阴性对照切片不与 反应混合，而是与标记液等量孵育。计数 阳性（细胞核染成棕色）心脏细胞的数量。每张切片随机选取 个视野（）计算凋亡率，计算公式如下：凋亡率（）（凋亡细胞数 总细胞数）。抗氧化指标测定 采用紫外分光光度计测定心脏中 活性和 含量，具体步骤按照试剂盒说明进行。将心脏组织从 超低温冰箱取出，每只鸡取 心脏样品于匀浆器中，用总蛋白提取试剂盒提取蛋白，上样前用蛋白定量试剂盒将各组的蛋白上样量统一调整为 ，然后按 的比例加入 上样缓冲液并 变性 。根据蛋白的分子质量大小提前配制合适浓度的 凝胶，电泳 后电转 ，等蛋白全部转移至聚偏二氟乙烯（）膜，膜稍加漂洗后用 的脱脂奶粉封闭 ，缓冲盐溶液漂洗 次，每次 后，放入配好的一抗，孵育 ，漂洗 次后根据不同一抗来源放入不同抗小鼠的免疫球蛋白（）孵育，漂洗 次后，最后通过超敏化学发光检测试剂盒及多功能成像仪检测目的蛋白 和 的表达情况，并以 肌动蛋白（）作为内参蛋白，采集的图片用 软件进行灰度值分析。实时荧光定量（）使用 试剂提取总，然后用 反转录成。反应总体系为 ，其中 和 液（总量 ），反应条件为 反应 ，反应 ，得到的 液加入 ，混匀，用于。根据 库中上传的所需基因的 序列，利用 软件设计相对应的引物，设计出的引物在 库中经比对之后，筛选出最佳的引物序列，将筛选出的引物序列发送至深圳华大基因股份有限公司进行合成的基因序列，试验所用的引物序列如表 所示。采用 试剂盒，反应体系为 ，包括 、上、下游引物各、溶液和 ，在 荧光定量 仪进行反应。反应程序为：预变性 ；变性，退火 ，个循环反应。试验结束后，将各样品的 值导出分析，采用 法计算。相关基因引物序列见表。图像与数据统计分析 将采集到的图片用 软件分析取值，所有数据均用 软件进行单因素方差分析，最小显著性差异法（）进行多重比较，表示差异极显著，表示差异显著，表示差异不显著。利用 绘制出柱状图。结果与分析 富硒饲粮对康乐黄鸡心脏组织病理变化的影响 结果显示，与 组相比，组中心肌纤维之间的小血管中出现大量红细胞，心脏组织界限不清、动 物 营 养 学 报 卷心肌纤维间隙增宽和心肌纤维断裂等病理情况；组和 组相比，能明显发现心脏组织界限更加清楚，断裂的心肌纤维虽仍存在但明显更少；最后对比 组和 组能明显发现 组组织轮廓更加清晰。以上结果表明，饲喂富硒饲粮能改善氧化应激对康乐黄鸡心脏的组织学结构造成的损伤（图）。表 相关基因引物序列 基因名称 引物序列 （）登录号 核转录因子：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶：肌动蛋白：组（对照组）心脏的 染色；、：组心脏的 染色；、：组心脏的 染色；：组心脏的 染色。：（）；，：；，：；：图 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏组织的影响（染色）（）富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏细胞凋亡的影响 结果显示，与 组相比，组心脏细胞凋亡率极显著升高（），组比 组细胞凋亡率极显著降低（）（图），组偶见 阳性细胞，图 图 可见正常细胞核为蓝色，而 阳性细胞核呈棕色，且具有核染色质浓缩、边集或碎裂等形态特征。阳性细胞数量的情况，可用凋亡率来表示，凋亡率越高，阳性细胞的数量越多，饲喂富硒饲粮能降低氧化应激康乐黄鸡心脏的细胞凋亡率。富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏抗氧化指标的影响 结果显示，与 组相比，组心脏 的活性显著降低（），组比 组心脏 活性极显著升高（），组比 组心脏 活性显著升高（）；与 组相比，组心脏 含量显著升高（），组比 组心脏 含量极显著降低（），组比 组心脏 含量显著降低（）（图）。期胡心宇等：富硒饲粮对农药 诱导的鸡心脏氧化应激和细胞凋亡的影响 ：组（对照组）心脏的细胞凋亡情况；：组心脏的细胞凋亡情况；：组心脏的细胞凋亡情况；：组心脏的细胞凋亡情况；：各组心脏细胞凋亡率。：；：；：；：；：；：。下图同。：；：图 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏细胞凋亡的影响 图 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏抗氧化指标的影响 富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏相关凋亡蛋白相对表达量的影响 结果显示，康乐黄鸡心脏 和 蛋白相对表达量在 组和 组、组和 组间并无统计学上的差异（）（图）。富硒饲粮对氧化应激康乐黄鸡心脏相关凋亡基因相对表达量的影响 结果显示，与 组相比，组心脏 和 的 相 对 表 达 量 显 著 上 升（）；但 与 组 相 比，组 心 脏 和 的 相对表达量均显著下降（）；组心脏 和 的 相对表达量比 组均显著下降（）（图）。讨 论 硒是动物体内一种必需的微量元素，在动物成长过程中起着抗氧化和抗应激的重要作用。而随着现代养殖业的高速发展，人们对畜禽的要求和需求量也越来越高，但在畜禽生长繁殖过程中，会受到生活环境中多方面的因素影响，农药 诱导的氧化应激就是其中一种，白丽花等的研究表明，当机体遭受 的刺激时，机体会产生过量活性氧，造成细胞膜的损伤和破坏信号通路，从而诱导细胞发生氧化应激。有研究表明，硒能够缓解 引起的氧化应激。硒能