基于转录组测序的摘除卵巢藏...肌脂代谢相关基因筛选与分析_袁建.pdf

3期669基于转录组测序的摘除卵巢藏姜母猪背最长肌脂代谢相关基因筛选与分析袁建，敖政，曾素梅，王智伟，赵中龙，季全，张勇*（贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025）摘要：【目的】探究摘除卵巢后藏姜母猪背最长肌脂肪沉积的动态规律，为揭示脂肪沉积的调控机制提供理论依据。【方法】于45日龄手术摘除藏姜母猪卵巢（试验组），对照组藏姜母猪在腹部相同部位进行创伤处理但不摘除卵巢。分别记录45、154和300日龄藏姜母猪的血清雌激素、甘油三酯和总胆固醇含量变化，300日龄屠宰采集背最长肌组织样品制作石蜡切片，并通过Illumina NovaSeq 6000测序平台完成测序。以|log2Fold Change|1且P0.05为标准，采用DESeq2筛选出背最长肌组织中的差异表达基因（DEGs），通过GO和KEGG数据库分别进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析，找出可能参与脂代谢的基因，并以实时荧光定量PCR进行转录组测序结果验证。【结果】试验组藏姜母猪的血清甘油三酯含量显著高于对照组藏姜母猪（P0.05，下同），总胆固醇含量极显著高于对照组藏姜母猪（P1 andP0.05.The GO and KEGG databaseswere used for GO functional annotation analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis respectively，to identi-fy genes that might be involved in lipid metabolism.The transcriptome sequencing results were verified by real-time fluo-rescence quantitative PCR.【Result】The serum triglyceride content of Zangjiang sows in the treatment group was signifi-cantly higher than that of the control group（P0.05，the same below），the total cholesterol content was extremely signifi-cantly higher than that of the control group（P1且P0.05，下同），但至154和300日龄时试验组藏姜母猪的血清甘油三酯含量显著高于对照组藏姜母猪（P0.05，下同）。在血清总胆固醇含量（图2）方面，摘除卵巢后（154和300日龄）试验组藏姜母猪的血清总胆固醇含量极显著高于对照组藏姜母猪（P0.01，下同）。至300日龄时，试验组藏姜母猪的血清雌激素含量极显著低于对照组藏姜母猪（图3）。2.2藏姜母猪背最长肌肉质分析结果至300日龄时，试验组藏姜母猪背最长肌的脂肪含量显著低于对照组藏姜母猪（图4）。显微镜观察背最长肌石蜡切片发现，试验组藏姜母猪肌肉切片中的肌束较完整，仅有少数出现碎片，组肌内脂肪含量也明显低于对照组藏姜母猪；对照组藏姜母猪肌肉切片中的碎片较多，极少观察到完整的脂肪细胞，且大多数脂肪细胞间无明显界限（图5）。2.3藏姜母猪背最长肌转录组测序数据分析结果对转录组测序得到的数据进行质控、过滤，以及与参考基因组进行比对，结果（表3）表明，8个样本4个试验组样本（Treat1Treat4）和4个对照组样本（CK1CK4）测序共获得444667400条Raw reads，平均每个样本获得55583425条Raw reads；过滤后共获得444666268条Clean reads；过滤后的总有效碱基数基因 GeneCCL4HK2PAHCENPAABRAPOSTNABATCXCL2GAPDH引物序列 Primer sequenceF：5-GACCCTCCCACCTCCTG-3R：5-GACCTGCCTGCCCTTTT-3F：5-GGAYGTGGTTTTAGTTTAGGAGTTTTT-3R：5-CTTTACAAAACTCAACCATAACCAAATAC-3F：5-GCCAAGGAGAAAGTGAGGA-3R：5-TTGATGGAGTCAGCCAGAA-3F：5-GGCCTTTCTGTTGTGACTG-3R：5-TCGCTGGATTGCTGGTA-3F：5-GGCCATCGCCAGAATCAAAC-3R：5-TGGCCCACTTGGCTGTATTT-3F：5-TCAAAACGGAAGGACCCATGAT-3R：5-TTGGTGACCTTGGTGACCTCTT-3F：5-GTGGTACCGGAGCAAGGAAA-3R：5-GCTAAGCAACCCATGGTCCT-3F：5-GAAGTTTGTCTCAACCCCGC-3R：5-ATCAGTTGGCACTGCTCTTGT-3F：5-CGTGGGTGGAATCATACTGGA-3R：5-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3基因ID Gene IDNM_213779.1来源文献（贺琴，2021）XM_021092656.1XM_013996269.2NM_001135960.2NM_001206347.1NM_214263.1NM_001001861.2XM_021091114.1退火温度（）Annealing temperature636256565656565656表 1实时荧光定量PCR扩增引物序列信息Table 1Real-time fluorescence quantitative PCR amplified primer sequence information图 1摘除卵巢藏姜母猪的血清甘油三酯含量变化趋势Fig.1Changes of serum triglyceride content in Zangjiang sowsafter ovary removal*表示差异显著（P0.05）。图4同*indicated significant difference（P0.05）.The same was applied inFig.4图 2摘除卵巢藏姜母猪的血清总胆固醇含量变化趋势Fig.2Changes of total cholesterol content in serum of Zang-jiang sows after ovary removal*表示差异极显著（P0.01）。图3同*indicated extremely significant difference（P0.01）.The same wasapplied in Fig.34.03.02.01.00.0甘油三酯含量（mmol/L）Triglyceride content45154300日龄 Daily age试验组 Treatment对照组 CK451543000.80.60.40.20.0*试验组 Treatment对照组 CK总胆固醇含量（mmol/L）Total cholesterol content日龄 Daily age3期673*600400200050000400003000020000100000*图 3300日龄藏姜母猪的血清雌激素含量比较Fig.3Comparison of serum estrogen content in serum of Zang-jiang sows at 300 days of age图 4300日龄藏姜母猪背最长肌的脂肪含量比较Fig.4Comparison of fat content of longissimus dorsi muscleof Zangjiang sows at 300 days of age图 5藏姜母猪背最长肌的组织切片Fig.5Tissue section of longissimus dorsi muscle of Zangjiang sow表 3各样本的转录组测序数据基本信息Table 3Basic information of transcriptome sequencing data of each sample试验组 Treatment对照组 CK样本SampleCK1CK2CK3CK4Treat1Treat2Treat3Treat4原始序列（条）Raw reads6212483857647878559086765000346656285080583493226074950643598634有效序列（条）Clean reads6212479657647836559086425000302856285036583493046074947243598154有效碱基数（Gb）Clean bases9.268.588.337.458.338.669.036.50错误率（%）Error rate0.020.020.030.030.020.020.020.02Q20（%）98.4898.5498.3398.1998.7098.4698.5498.35Q30（%）94.4094.6393.8393.6695.2694.3694.6594.19GC含量（%）GC content47.5047.4847.3548.2746.2445.9447.3146.73100 m100 m100 m100 m100 m100 m试验组 Treatment对照组 CK试验组 Treatment对照组 CK雌激素含量（ng/L）Estrogen content脂肪含量（g/g）Fat content（Clean bases）为66.14 Gb，各样本的Clean bases范围在6.509.26 Gb；测序错误率为0.02%0.03%，Q20在98.19%98.70%，Q30在93.66%95.26%，GC含量在46.73%48.27%。转录组测序数据与参考基因组进行序列对比，结果显示，各样本的总映射率为96.39%96.98%，多个映射率为4.58%5.13%，唯一映射率为91.35%92.11%，正比对（Reads map to+）为45.64%46.03%，反比对（Reads map to-）为45.71%46.08%，整段比对（Non-splice reads）为55.66%61.75%，分段比对（Splice reads）为29.89%33.94%（表4）。2.4藏姜母猪背最长肌转录组质量评估结果主成分分析（PCA）结果显示，藏姜母猪背最长肌转录组测序数据表现为组内聚集、组间分离（图6）。采用DESeq2对藏姜母猪背最长肌组织转录组测序数据进行DEGs筛选，结果显示试验组与对照组藏姜母猪间共存在278个DEGs（图7），其中上调的DEGs有151个、下调的DEGs有127个。对278个DEGs进行聚类分析，结果也表明组内基因表达相似度较高，而组间表达分离（图9）。袁建等：基于转录组测序的摘除卵巢藏姜母猪背最长肌脂代谢相关基因筛选与分析54卷南 方 农 业 学 报 6742.5DEGs的GO功能注释及KEGG信号通路富集分析结果DEGs的GO功能注释分析结果显示，共注释到43个可能与脂代谢相关的GO功能条目（图9）。其中，参与生物过程（Biological process）的有19个功能条目，包括调节Toll样受体9信号通路（Regulation oftoll-like receptor 9 signaling pathway）、胆汁酸分泌（Bile acid secretion）、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导调控（Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase sig-naling）、蛋白激酶B信号传导（Regulation of proteinkinase B signaling）、磷脂酰肌醇介导的信号传导（Phosphatidylinosi