杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析_张震.pdf

3期743杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析张震1，伍仲平2，邓雅鑫1，唐军旺1，李慧1，蔡妙灵1，王丽萍1*，季久秀3*（1桂林医学院智能医学与生物技术学院，广西桂林541199；2仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；3临沂大学农林科学学院，山东临沂276000）摘要：【目的】比较杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异，为揭示猪外耳面积变异的分子机制提供参考。【方法】采集100日龄全同胞雄性杜洛克（n=5）和二花脸（n=5）猪外耳软骨组织进行石蜡切片及HE染色和Masson三色染色，对比两者结构上的区别；体外分离培养耳软骨细胞，使用CCK8法检测其增殖能力；联合转录组测序，比较二花脸（n=3）和杜洛克（n=3）耳软骨组织中基因表达的差异，筛选影响软骨生长相关的基因并使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行验证。【结果】HE染色和Masson三色染色结果显示，与杜洛克相比，二花脸耳软骨细胞形成更多的由28个细胞组成的同源细胞群，软骨组织中含有更多的弹性纤维。细胞增殖检测试验表明，二花脸耳软骨细胞在体外培养36、48和60 h后增殖速率显著大于杜洛克（PA）为因果突变。Duan等（2013）进一步研究表明PPARD G32E突变是一个功能缺失突变，该突变改变了PPARD蛋白的亚细胞定位和翻译后修饰水平，从而降低其对靶基因的转录激活能力。PPARD激活后加速软骨干细胞的凋亡，并刺激软骨细胞的终末分化（Zhang et al.，2017）。Li等（2012）在白色杜洛克与二花脸杂交F2代群体中利用微卫星标记鉴别到HMGA2基因为5号染色体上影响二花脸外耳面积的重要基因。高迁移率蛋白HMGA2是一种转录调节因子，可显著促进软骨细胞的增殖（Richter et al.，2009，2011），通过下调间充质细胞中的Osterix表达参与骨生成（Negishi et al.，2022）。Liang等（2019）在大白东北民猪杂交群体和北京黑猪群体中还发现WIF1基因c.1167CG是5号染色体上另一个与猪耳大小相关的重要突变。WIF1蛋白是一种Wnt信号通路抑制剂，其通过与Wnt蛋白结合，从而阻断Wnt信号传导途径（Hsieh et al.，1999）。WIF1蛋白N末端包含WIF结构域和5个表皮生长因子样（Epidermal growth factor-like，EGF）重复序列，与骨细胞合成代谢相关（Krause and Gregory，2012），特别是抑制成骨细胞分化（Morimoto et al.，2017）。此外，MSRB3、LEMD3和GRIP1等基因也被报道与猪外耳面积变异相关（Chen et al.，2018；Xu et al.，2020）。【本研究切入点】影响杜洛克和二花脸外耳大小的主效基因或突变位点虽已部分阐明，但杜洛克son trichrome stainings revealed that compared to Duroc，Erhualian ear chondrocytes formed more isogenous groups con-sisting of 2-8 cells，and the cartilage tissues contained more elastic fibers.The cell proliferation ability testing demon-strated that the proliferation rate of Erhualian ear chondrocytes was significantly higher than that of Duroc after 36，48，and 60 h of in vitro culture（PA位点进行基因型判定。另一部分软骨组织放入液氮中速冻，用于后期组织RNA提取。1.2耳软骨组织的切片及染色取出置于4%中性多聚甲醛中固定72 h的耳软骨，流水冲洗4 h后用剪刀将软骨修整成正方形小块进行切片。于酒精中逐级脱水后置于二甲苯中进行组织透明，浸蜡包埋后切片，切片厚度为5 m。切片经HE染色后用中性树脂封固。Masson三色染色法依次经Weigert苏木素、Masson、磷钼酸、苯胺蓝和冰醋酸处理后，用中性树脂封片，在显微镜（NikonECLIPSE Ti）下进行观察拍照。1.3耳软骨细胞的分离培养和生长曲线测定使用型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司）法消化100日龄杜洛克和二花脸耳软骨组织获得细胞（伍仲平等，2015），细胞培养于含有20%胎牛血清（Oricell）、1青链霉素的DMEM/F12（Gibco）完全培养基中，待细胞密度达80%左右进行传代，使用细胞计数板以104个细胞将杜洛克和二花脸耳软骨细胞接种至12孔板中。使用CCK8细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）分别在接种后第24、36、48和60 h检测耳软骨细胞的OD值（450 nm），并于培养36 h后在显微镜（Nikon E200）下观察细胞形态并拍照。1.4mRNA测序和数据处理将冻于液氮中的耳软骨组织经研磨后加入TRIzol试剂（ThermoFisher Scientific），使用氯仿异丙醇提取总RNA。确认样本RNA完整系数RIN值7.0，纯度值（28S/18S）1.0后，用于cDNA文库制备。于HiSeq 4000测序仪上进行测序，每个样本得到约25107条 Clean reads。BWA比对到猪参考基因组Sscrofa 11.1版本后，使用每百万碱基对转录序列的每千碱基读取数（Reads per kilobase per millionmapped reads，RPKM）标准化每个基因的表达量。利用DESeq2进行差异表达分析，Padj0.05、|log2FoldChange|1作为DEGs的阈值。在GeneCards（https:/www.genecards.org）进行基因信息和功能查询，使用基因本体（Gene ontology，GO）进行DEGs功能分析。Metascape（http:/metascape.org/）进行DEGs通路富集分析（Zhou et al.，2019），利用ggplot2绘制DEGs火山图、聚类热图和基因通路图。用String网站（https:/string-db.org/）分析DEGs编码蛋白的相互作用关系，combined score设定为0.4构建蛋白互作网络（Protein-protein interaction network，PPI）（Szklarczyk et al.，2021）。将String计算得到的PPI网络导入到Cytoscape3.8.0（http:/www.cytoscape.org/）中，使用CytoHubba插件计算基于拓扑和生物学属性的关键节点基因。1.5DEGs的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证根据逆转录试剂盒（Takara）说明书方法将测序剩余的1 g总RNA逆转录成cDNA后，利用NCBIPrimer-BLAST（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）设计引物（表1）。使用生工生物工程（上海）股份有限公司合成的引物进行预试验，验证引物的有效性和特异性后进行正式试验。qRT-PCR在6个样本中检测9个基因的表达量，每个样本重复检测3次。反应体系20.0 L：cDNA 2.0 L、正向引物0.8 L、反向引物 0.8 L、2TB Green Fast qPCR Mix 10.0 L（TaKaRa）、DEPC ddH2O 6.4 L。于ABI 7900 Fast荧光定量分析仪（美国应用生物系统公司）上进行扩增。扩增程序：95 预变性30 s，95 5 s，退火和延伸30 s，进行40个循环，收集荧光数值。以ACTB为内参基因，采用标准曲线法计算8个基因相对于ACTB基因的表达量。使用GraphPad进行图形展示（https:/ 方 农 业 学 报 746小而竖立的耳型，同日龄的二花脸外耳面积远大于杜洛克（图1-A，直尺为参照物）。采集100日龄全同胞二花脸和杜洛克猪外耳软骨组织，提取表面皮肤DNA，利用PCR检测PPARD基因g.61339 GA位点进行品种鉴定，结果显示，杜洛克PPARD基因g.61339 GA突变位点等位基因型全为G，二花脸则全为A（图1-B），与预期相符，说明样品采集无误（Ren et al.，2011）。2.2杜洛克和二花脸耳软骨组织切片染色分析结果哺乳动物的耳软骨组织由细胞、基质和纤维构成。耳间质中含有大量交织分布的弹性纤维，具有较强的弹性（Visscher et al.，2019）。软骨细胞在软骨陷窝内（图2中*所示）生长和分裂的同时不断地向细胞外分泌基质，使软骨体积从内部增大，耳廓软骨的这种生长方式被称为间质生长或软骨内生长（Myers and Ateshian，2014）。由一个软骨细胞分裂形成的多个相邻细胞组成同源细胞群（Ng et al.，2012）（图2中圆圈所示），同源细胞群包含在一个大的软骨陷窝内，里面又分成数个小的陷窝，内各含一个软骨细胞。为比较杜洛克和二花脸耳软骨组织的结构差异，对同日龄杜洛克和二花脸耳软骨组织进行石蜡切片并进行HE和Masson三色染色。HE染色结果（图2-A）显示：与杜洛克相比，二花脸软骨细胞分裂形成更多的由28个细胞组成的同源细胞群。软骨细胞向四周分泌以硫酸软骨素为主的细胞外基质，硫酸软骨素是弹性纤维的重要组成部分。二花脸软骨组织同源细胞群附近着色更深，提示二花脸软骨组织内硫酸软骨素和弹性纤维含量高于杜洛克。进一步采用Masson三色染色对软骨进行染色，结果如图2-B所示，二花脸耳软骨组织中具有更多处于分裂状态的细胞，杜洛克大软骨陷窝主要以2个细胞组成，二花脸大软骨陷窝内主要由3个以上细胞组成。此外，二花脸组织中含有大量弹性纤维（图2中浅紫色条状所示），杜洛克中弹性纤维含量较少，具有较多被染色液染成绿色的胶原纤维（图2中箭头所示）。引物PrimerCOL2A1-FCOL2A1-RMMP3-FMMP3-RBGLAP-FBGLAP-RGDF5-FGDF5-RDKK1-FDKK1-RWNT10B-FWNT10B-RAXIN2-FAXIN2-RHMGA2-FHMGA2-RACTB-FACTB-R序列Sequence5-CAGGATGGGCAGAGGTATAATG-35-GAGGCAGTCTTTCAGGTCTTC-35-GTGGCAGTTTGCTCAAGTTATC-35-GGTTGTAGTAGTCTTCCAGGTATTT-35-CTCACACTGCTTGCCCTACT-35-CCGCATCATACCTGCACCTT-35-CAACACCATCACCAGCTTTATTG-35-CTTCTCCAGGGCGCTAATG-35-AGCGTTGTTACTGTGGAGAAG-35-TCTCTGACAGGTGTGAAGTCTA-35-AGTTCTCTCGGGATTTCTTGG-35-CTTGCATTTCCGCTTCAGATT-35-CTTTCCTGGAGAGGGAGAAATG-35-TGCTTTGGCTACTCGTAAAGT-35-AAATGGCCACAGCAAGTCGT-35-TGCAGTGTCTTCTCCCTTCAA-35-GACTACCTCCTGTCTGCTGAG-35-GGTTTCTGTGCCTCACTCCC-3扩增基因名称Amplified gene nameCOL2A1MMP3BGLAPGDF5DKK1WNT10BAXIN2HMGA2ACTB扩增片段（bp）Amplified fragment123971059792122110152114退火温度（）Annealing temperature585860615857586060表 1引物列表Table 1List of primers图 1100日龄杜洛克与二花脸外耳形态（A）及其PPARDg.61339 G