HJ 1016-2019 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法.pdf

中华人民共和国国家环境保护标准中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 1016-2019 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法 Water qualityIdentification of mutagenicity Vicia faba root-tip micronucleus test（发布稿）本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。2019-04-13 发布 2019-09-01 实施生态生态环境部环境部 发 布 i 目 次 前 言.ii 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.1 5 试剂和材料.2 6 仪器和设备.3 7 受试生物.3 8 受试生物准备.3 9 样品.4 10 分析步骤.4 11 结果计算与表示.6 12 精密度.7 13 质量保证和质量控制.7 14 废物处理.8 附录 A（资料性附录）有丝分裂各期细胞、根尖细胞微核计数区及微核判定参考图片.9 附录 B（资料性附录）松滋青皮豆特性及保种.11 附录 C（资料性附录）根尖处理皿参考图片.12 附录 D（规范性附录）试样急性毒性预试验.13 附录 E（资料性附录）Kruskal-Wallis 检验方法.14 附录 F（资料性附录）原始记录表和试验报告表.16 ii 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护生态环境，保障人体健康，规范水样致突变性的鉴别方法，制定本标准。本标准规定了鉴别地表水、地下水、生活污水和工业废水中致突变性的蚕豆根尖微核试验法。本标准的附录D为规范性附录，附录A附录C、附录E、附录F为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心（江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室）、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室。本标准验证单位：上海市环境监测中心、浙江省环境监测中心、江苏省环境监测中心、江苏省南京环境监测中心、江苏省苏州环境监测中心和江苏省泰州环境监测中心。本标准生态环境部2019年4月13日批准。本标准自2019年9月1日起实施。本标准由生态环境部解释。1 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法 1 适用范围 本标准规定了鉴别水样致突变性的蚕豆根尖微核试验法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的致突变性鉴别。2 规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。GB/T 6920 水质 pH 值的测定 玻璃电极法 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 微核 micronuclei 真核细胞中，游离于主核之外的小核即为微核，其物质构成和特性与主核一致，大小一般为主核 1/3 以下，是染色体畸变的一种表现形式。3.2 微核率 micronucleus rate 某一试样检测若干根尖，每个根尖观察1 000个有丝分裂间期细胞，所计微核数占观察细胞数的比率，以计。3.3 有丝分裂指数 mitotic index 同一根尖观察 1 000 个细胞，处于有丝分裂期（包含前期、中期、后期、末期，见附录A 图 A.1）的细胞数占总细胞数的比率，以计。3.4 参比物质 reference substance 验证测试方法敏感性和有效性的已知阳性对照物质，用于确定受试生物特性和试验条件未发生明显改变，保证试验可靠有效。4 方法原理 将经过浸种催根后长出的蚕豆初生根在试样中暴露一定时间，经恢复培养、固定、染色 2 后，制片镜检，统计蚕豆根尖初生分生组织区（参见附录 A 图 A.2）细胞微核率。致突变物可作用于细胞核物质，导致有丝分裂期染色体断裂形成断片、整条染色体脱离纺锤丝、纺锤丝牵引染色体移动的功能受损。这些移动受到影响的染色体断片或整条染色体不能随正常染色体移向细胞两极形成子细胞核，而滞留细胞质中形成子细胞微核并引起其数量增加。比较试样与空白试样蚕豆根尖细胞微核率是否显著增加，可判定样品是否存在致突变性。5 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水，电导率（25）0.50 mS/m、pH（25）在 5.57.5 之间。5.1 调温水：用于浸种（8.2）、催根（8.3）、根尖处理（10.1）的实验用水，需提前放置于恒温培养箱（6.3）中，251平衡至恒温备用。5.2 盐酸：（HCl）=1.18 g/ml。5.3 氢氧化钠（NaOH）。5.4 乙酸：（C2H4O2）=1.05 g/ml。5.5 无水乙醇：（C2H6O）=0.79 g/ml。5.6 碱性品红（C20H20ClN3）。5.7 偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）或偏重亚硫酸钾（K2S2O5）。5.8 活性炭粉。5.9 环磷酰胺（C7H15Cl2N2O2P H2O），生物试剂（BR），纯度99.0%，本标准参比物质。5.10 盐酸溶液：c（HCl）=1.0 mol/L。量取 8.3 ml 盐酸（5.2），缓慢加入少量水中，搅拌混匀后用水定容至 100 ml。5.11 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=1.0 mol/L。称取 4.0 g 氢氧化钠（5.3），加入少量水中，搅拌溶解后用水定容至 100 ml。5.12 卡诺氏液（乙酸-无水乙醇混合液）：1+3。将乙酸（5.4）和无水乙醇（5.5）按 1:3 的体积比混合，临用现配。5.13 乙醇溶液：（C2H6O）=70%。量取无水乙醇（5.5）70 ml，用水定容至 100 ml。5.14 席夫（Schiff）试剂：可使用市售的成品试剂。也可按照以下方式配置：在 100 ml烧瓶中加入 5.0 ml无水乙醇（5.5）和 0.5 g碱性品红（5.6），振荡溶解10 min。将 2.5 g 偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（5.7）溶解于 93 ml 水后，加入上述烧瓶中，混匀，继续加入 1.5 ml 盐酸（5.2），避光振荡至完全溶解，此时溶液呈浅黄色。再加入 0.2 g 活性炭粉（5.8），振荡 3 min，过滤溶液使之无色，保存备用。此溶液在 4以下冷藏避光可保存 6 个月，如溶液呈粉红色或出现沉淀，则不可再用。5.15 SO2漂洗液：w（Na2S2O5或 K2S2O5）=0.5%。称取 10.0 g 偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（5.7）溶于 90 ml 水中，得到 w（Na2S2O5或K2S2O5）=10%的溶液。分别吸取该溶液和盐酸溶液（5.10）各 5.0 ml 于 100 ml 容量瓶中，用水定容至刻度，临用现配。3 5.16 乙酸分散液：（C2H4O2）=45%。量取 45 ml 乙酸（5.4），用水定容至 100 ml，临用现配。5.17 环磷酰胺参比溶液：（C7H15Cl2N2O2P）=20.0 mg/L。称取 0.107 g 环磷酰胺（5.9）加入少量水中，搅拌溶解后用水定容至 100 ml。吸取该溶液 20.0 ml，用水定容至 1 000 ml，临用现配。6 仪器和设备 配制环磷酰胺参比溶液（5.17）及试样稀释时使用符合国家标准的 A 级玻璃量器，其他可使用符合国家标准的 B 级玻璃量器。6.1 冷藏采样箱：08。6.2 生物显微镜：物镜 10、20、40，目镜 10 或 15。6.3 恒温培养箱：25 1。6.4 冰箱：冷藏温度 08，冷冻温度-18。6.5 电子天平：分度值 0.000 1 g。6.6 恒温水浴锅：20100，控温精度 1。6.7 根尖处理皿：直径12 cm、高度3 cm，可自制（参见附录 C）。6.8 生物实验室常用设备和器材。7 受试生物 受试生物为松滋青皮豆，是原产于湖北省松滋县的一种中粒蚕豆（Vicia faba），经筛选及长期纯化保种，其遗传特性相对稳定，对致突变物较为敏感。可直接购买或自行保种，其特性及保种应符合附录 B 的要求。本试验以其初生根为受试器官。8 受试生物准备 8.1 选种 按照每一试样约需 50 粒松滋青皮豆的数量，挑选颗粒饱满、豆皮青绿或青棕色、大小一致、无病虫害、表面无明显缺损的豆种，实验用水洗净。8.2 浸种 按照每 1 000 ml 烧杯中最多 300 粒豆种的数量浸种，在烧杯中加调温水（5.1）过 1 000 ml刻度，于恒温培养箱（6.3）中 25 1避光浸泡至豆种充分吸胀。浸种约需 26 h30 h，可在 18 h 和 24 h 时换水，若出现浑浊，则增加换水频次。8.3 催根 将医用纱布浸洗 3 次后拧干，叠 4 层垫入洁净的搪瓷盘内，加少量调温水（5.1）至纱布充分润湿。调温水（5.1）用量以倾斜搪瓷盘，在最低处见少量溢水为宜。豆种（8.2）用 4 调温水（5.1）漂洗后，均匀排布于搪瓷盘内，覆盖 2 层充分润湿的纱布，纱布含水量以悬挂时刚好无水下滴为宜。盖上搪瓷盘盖，于恒温培养箱（6.3）中 25 1避光催根 62 h66 h。催根期间，每日检查 2 次，注意及时补水保持纱布处于刚被充分润湿的状态，随时去除不出根、霉变、根尖枯死、根尖形态或颜色异常的豆种，如下垫纱布出现粘性分泌物，及时清洗更换。9 样品 9.1 样品采集 按照HJ/T 91或HJ/T 164的要求进行样品采集，根据样品性质选用1 000 ml及以上容量的采样瓶。采样瓶可以为棕色玻璃瓶或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器。采样时应注意将样品沿瓶壁缓慢倒入采样瓶，样品与瓶塞之间不留空隙。注：为保证尽快开展测试，采样时间应尽量安排在催根（8.3）步骤的末期。9.2 样品保存 样品采集后，于 8以下冷藏避光保存，在 48 h 内进行试验。样品若需长期保存，须充分混匀分装并留有适当空隙，于-18以下冷冻保存，保存期不超过 2 个月。9.3 试样制备 样品在恒温培养箱（6.3）中 25 1避光平衡至恒温，充分混匀后，加满至根尖处理皿（6.7），与盖板间略留空隙，待测。测试前按照 GB/T 6920 方法测定并记录 pH 值。在-18以下保存的样品，应先在不超过 25的水浴中轻微振荡解冻，或在 8以下冷藏过夜解冻。注：试样适宜的 pH 值范围为 5.58.5，过高或过低的 pH 值可能会对试验产生影响。当试验结果需包含该影响，或者调节 pH 值会引起样品物理变性、化学反应时，则不调节样品 pH 值；当样品 pH5.5 或8.5 时，可用盐酸溶液（5.10）或氢氧化钠溶液（5.11）调节 pH 值至适宜范围。根据监测目的，可单独或同时对调节前、后的试样开展试验。9.4 对照试样 9.4.1 用实验用水代替样品，按照与试样制备（9.3）相同步骤制备用于阴性对照试验的空白试样。9.4.2 以环磷酰胺参比溶液（5.17）代替样品，按照与试样制备（9.3）相同步骤制备用于阳性对照试验的参比试样。10 分析步骤 10.1 根尖处理 挑选初生根长 1.5 cm2.0 cm 且生长发育良好的豆种（8.3），在 9.3 步骤的每个根尖处 5 理皿中插入 1012 粒豆种，确保根尖没入试样至少 1.0 cm，于恒温培养箱（6.3）中 25 1避光放置 6 h。取出豆种，用调温水（5.1）浸洗 3 次（每次 5 min）后，按照 8.3 规定的条件恢复培养24 h。处理过程中，根尖如出现附录 D 中描述的急性毒性症状，则按附录 D 的要求增加试样急性毒性预试验；否则，直接进行后续试验。10.2 根尖固定 切取顶端 l.0 cm 左右根尖（10.1）置于具盖指管内（同一试样处理的根尖放入一个指管），加卡诺氏液（5.12）固定 2 h。固定时间最长不超过 24 h。如不能及时染色制片，则弃去卡诺氏液，用实验用水洗净，加入乙醇溶液（5.13）浸没，于冰箱内冷藏，72 h 内染色镜检。10.3 孚尔根（Feulgen）染色 实验用水浸洗根尖（10.2）2 次，每次 5 min。取 60水浴平衡后的盐酸溶液（5.10），快速加入指管