HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法.pdf

中华人民共和国国家环境保护标准中华人民共和国国家环境保护标准 HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法 Water qualityDetermination of the acute toxicity Zebrafish(Danio rerio)eggs method （发布稿）本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。2019-12-31 发布 2020-06-30 实施生态环境部生态环境部 发 布 i 目 次 前 言.1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 方法原理.2 5 干扰和消除.2 6 试剂和材料.2 7 仪器和设备.3 8 样品.4 9 试验步骤.5 10 结果计算与表示.7 11 有效性、敏感性与精密度.7 12 质量保证和质量控制.8 13 试验报告.8 14 废弃物处置.8 附录 A（资料性附录）斑马鱼卵相关发育阶段.9 附录 B（资料性附录）斑马鱼种鱼驯养及维持.10 附录 C（资料性附录）产卵盒参考图片.11 附录 D（资料性附录）斑马鱼卵鉴别.12 附录 E（资料性附录）24 孔细胞培养板试验布局设置方案.15 附录 F（资料性附录）推荐的数据记录表.16 附录 G（资料性附录）寇式法计算 EC50.18 ii 前 言 为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护生态环境，保障人体健康，规范水质急性毒性测定的斑马鱼卵方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中急性毒性的斑马鱼卵法。本标准的附录 A附录 G 为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室。本标准验证单位：中国环境科学研究院环境分析测试技术中心、中国环境监测总站、生态环境部南京环境科学研究所、浙江省环境监测中心、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所和江苏国创环保科技有限公司。本标准生态环境部2019年12月31日批准。本标准自2020年6月30日起实施。本标准由生态环境部解释。1 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法 1 适用范围 本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。2 规范性引用文件 本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。GB/T 6920 水质 pH 值的测定 玻璃电极法 GB/T 13267 水质 物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法 HJ 91.1 污水监测技术规范 HJ 506 水质 溶解氧的测定 电化学探头法 HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 鱼卵 fish egg 指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞，斑马鱼卵相关发育阶段参见附录 A。3.2 稀释倍数 dilution level 原水样占稀释后水样总体积分数的倒数，一般用 D 来表示。例如，水样未稀释，则稀释倍数 D=1；取 250 ml 水样稀释至 1000 ml（即体积分数为 25%），则稀释倍数 D=4。3.3 最低无效应稀释倍数 lowest ineffective dilution 测试中不产生测试效应的最低稀释倍数，本标准指不少于 90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数，用 LID 表示。3.4 半数效应浓度 EC50 指暴露48 h后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数，用EC50表示。本标准中 EC50即半数致死浓度 LC50。2 3.5 参比物质 reference substance 测试中，用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质，如本标准中 3,4-二氯苯胺。4 方法原理 使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将 4-细胞期128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在 261的条件下培养 48 h，根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算 LID 或 EC50值，表征水样的急性毒性。5 干扰和消除 水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8）中吸出一定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴管（7.11）将原水样移回，恢复原有暴露体积。6 试剂和材料 6.1 受试生物 6.1.1 种鱼 使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长 3.5 cm 左右，鱼龄在 6 月24 月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前 6 个月不予使用任何药物。种鱼驯养及维持具体条件见附录 B。6.1.2 鱼卵 确保试验鱼卵受精率70%，处于 4-细胞期128-细胞期（见附录 A）。6.2 试剂 除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水，满足 pH 值 6.58.5，电导率10 S/cm 的要求。6.2.1 氢氧化钠（NaOH）。6.2.2 氯化钙（CaCl2 2H2O）。6.2.3 硫酸镁（MgSO4 7H2O）。6.2.4 碳酸氢钠(NaHCO3)。6.2.5 氯化钾（KCl）。6.2.6 3,4-二氯苯胺（C6H5Cl2N），优级纯。6.2.7 盐酸：（HCl）=1.19 g/ml。3 6.2.8 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。量取 8.3 ml 盐酸（6.2.7），用水定容至 1 000 ml。6.2.9 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1 mol/L。称取 4 g 氢氧化钠（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。6.2.10 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液：（C6H5Cl2N）=100 mg/L。称取 0.05 g 3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水（6.2.16）定容至 500 ml，静置 24 h，调节 pH 值至 7.0。避光冷藏保存，储备液可储存 6 个月。6.2.11 参比物质 3,4-二氯苯胺工作液：（C6H5Cl2N）=3.7 mg/L。量取 3.7 ml 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水（6.2.16）定容至 100 ml，使用前按 8.2.1 步骤平衡至 261。该溶液作为阳性对照，临用前现配。6.2.12 氯化钙储备液：（CaCl2 2H2O）=11.76 g/L。称取 11.76 g 氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。6.2.13 硫酸镁储备液：（MgSO4 7H2O）=4.93 g/L。称取 4.93 g 硫酸镁（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。6.2.14 碳酸氢钠储备液：（NaHCO3）=2.52 g/L。称取 2.52 g 碳酸氢钠（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。6.2.15 氯化钾储备液：（KCl）=0.22 g/L。称取 0.22 g 氯化钾（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。6.2.16 标准稀释水。将氯化钙储备液（6.2.12）、硫酸镁储备液（6.2.13）、碳酸氢钠储备液（6.2.14）和氯化钾储备液（6.2.15）四种储备液各 25 ml 混合，用水定容至 1 000 ml。7 仪器和设备 7.1 冷藏采样箱：28；7.2 pH 计：测量范围 014，最小分度为 0.1 pH 单位；7.3 溶解氧测定仪：测量范围 0 mg/L20 mg/L，最小分度为 0.1 mg/L；7.4 倒置显微镜或体视显微镜：最小放大倍数为 30；7.5 冰箱：冷藏室 28；冷冻室-18；7.6 恒温培养箱或恒温室：温度可调至 261；7.7 斑马鱼养殖系统：包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统；7.8 多孔细胞培养板：每孔容积 2.5 ml5 ml 或采用其它相同功能的细胞培养板，可选择市售；7.9 产卵盒：惰性材料，推荐尺寸：20 cm10 cm11 cm（参见附录 C），可选择市售；7.10 温度计：050；7.11 塑料滴管：5 ml，口径大于 3 mm；7.12 一般实验室常用器皿和设备。4 8 样品 8.1 样品的采集和保存 根据样品性质及监测需要使用 1 000 ml 及以上容量的棕色玻璃瓶（或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器）按照 HJ 91.1、HJ/T 91 或 HJ/T 164 的要求进行水样的采集，水样沿瓶内壁缓慢倒入，并与瓶塞间不留空隙。水样采集后，立即于 28避光运输和保存，并尽快进行试验，保存时间最长不超过 48 h。水样若需长期保存，则上述水样采集后应尽快送回实验室冷冻（-18）保存，保存前将水样充分混匀后按每 1000 ml 容器盛装 500 ml700 ml 水样的量分装，保存期不超过 2 个月。8.2 样品预处理 8.2.1 温度 冷冻保存的水样需在不超过 25水浴轻微振荡解冻，或在 28冷藏过夜解冻。受试水样在试验开始前，放置于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，261避光平衡至恒温后用于试验。8.2.2 pH 值 按照 GB/T 6920 方法测定水样 pH 值。当 pH 值6.5 或 pH 值8.5 时，使用盐酸溶液（6.2.8）或氢氧化钠溶液（6.2.9）调节水样 pH 值至 6.58.5，尽量减少酸碱调节液的用量，以减少对水样浓度的影响。测定并记录调节后的水样 pH 值，按后续步骤进行水样测定。当 pH 值的影响需要反映在试验结果中或者调节 pH 值会引起水样物理变性或化学反应时，则不调节水样 pH 值。根据水样测定的实际需求，也可对 pH 值调节前后的水样同时开展试验比较。8.2.3 溶解氧 按照 HJ 506 方法测定水样溶解氧浓度，确保用于暴露试验（9.3）步骤中的每个稀释水样中初始溶解氧浓度不低于 4 mg/L（大约 50%饱和度）。若要充氧，溶解氧浓度不超过相应饱和溶解氧值。8.3 样品稀释 8.3.1 预实验 当浓度难以预估时需进行预试验，以稀释比为 10 选择 3 个连续浓度的稀释水样，每一浓度以 5 粒鱼卵按 9.39.6 部分进行试验，以确定鱼卵死亡率 100%0%与稀释水样浓度大致对应的范围。8.3.2 测定 LID 时稀释 为保证最高稀释倍数水样鱼卵存活率90%、最低稀释倍数水样鱼卵存活率尽可能 5 90%，一般选择连续的 4 个5 个（鱼卵存活率与水样浓度的大致对应关系已知时选 2 个3 个）稀释倍数水样，水样的稀释参照表 1。表 1 水样的稀释 稀释倍数 D 原水样占稀释后水样总体积分数（%）形成的稀释水样 稀释水样的组成（ml）所需标准 稀释水 所需水样体积 所得稀释水体积 1 100.0 1倍稀释水样（即原水样）0 原水样 200 200 2 50.0 2 倍稀释水样 100 原水样 100 200 3 33.0 3 倍稀释水样 140 原水样 70 210 4 25.0 4 倍稀释水样 100 2 倍稀释水样 100 200 6 16.7 6 倍稀释水样 100 3 倍稀释水样 100 200 8 12.5 8 倍稀释水样 100 4 倍稀释水样 100 200 12 8.3 12 倍稀释水样 100 6 倍稀释水样 100 200 16 6.2 16 倍稀释水样 100 8 倍稀释水样 100 200 24 4.2 24 倍稀释水样 100 12 倍稀释水样 100 200 32 3.1 32 倍稀释水样 100 16 倍稀释水样 100 200 8.3.3 测定 EC50时稀释 为保证稀释水样最大浓度的死亡率为 100%或与之