DB53T 760.3-2016 云南半细毛羊养殖 第3部分：胚胎移植.pdf

DB53/T 760.32016 云南半细毛羊养殖 第 3 部分：胚胎移植 2016-09-10 发布 2016-12-01 实施ICS 65.020.30 B 40 中华人民共和国国家质量监督 检验检疫总局备案号：52077-2016 云南省地方标准 云南省质量技术监督局 发 布 DB53/T 760.32016 I 前 言 DB53/T 760-2016云南半细毛羊养殖分为以下部分：第1部分：品种 第2部分：人工授精；第3部分：胚胎移植；第4部分：营养需要；第5部分：饲草饲料；第6部分：饲养管理；第7部分：疫病防治；第8部分：羊舍建设；第9部分：档案管理。本部分为DB53/T 760的第3部分。本部分按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本部分由云南省农业厅提出。本部分由云南省农业标准化专业技术委员会（YNTC07）归口。本部分起草单位：云南省畜牧兽医科学院。本部分主要起草人：权国波、洪琼花、杨红远、李东江、兰蓉、邵庆勇、赵远崇、曾明洋。DB53/T 760.32016 1 云南半细毛羊养殖 第 3 部分：胚胎移植 1 范围 本部分规定了供体羊的选择与饲养管理、超数排卵和配种、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻与解冻、胚胎移植等技术要求。本部分适用于云南半细毛羊快速扩繁。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 826 绵羊胚胎移植技术规程 NY5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 DB53/T760.2 云南半细毛羊养殖 第2部分：人工授精 3 供体羊的选择与饲养管理 3.1 供体羊的选择 供体羊应符合以下条件：a)符合云南半细毛羊的典型特征，系谱清楚，遗传性能稳定，种用价值高；b)健康、体质健壮、膘情中等及以上；c)发情周期正常，生殖机能正常，无遗传性或传染性疾病；d)年龄 1.5 周岁5 周岁，体重 40 kg 以上；e)经产母羊产后 90 d 以上，生殖机能恢复正常。3.2 饲养管理 供体羊的饲养管理应满足以下要求：a)分群饲养，专人管理；b)保持饲养环境相对稳定，饲养环境卫生、干燥、圈舍温度适宜，避免应激反应；c)加强饲养，保证营养均衡；饮水按 NY5027 要求执行。4 超数排卵和配种 4.1 超数排卵 4.1.1 超排激素 FSH（促卵泡素）、P（孕酮，激素包埋在硅胶内，埋置于阴道内缓慢释放）。DB53/T 760.32016 2 4.1.2 超排方法 于发情周期的任意一天埋置阴道孕酮硅胶栓（CIDR），计为第1 d，第8 d更换第二个CIDR，第12 d开始采用等量法每天早、晚间隔12 h各注射一次FSH，连续注射4 d共8 次，在第7次注射FSH时取出CIDR；FSH注射总剂量按供体羊体重计算，宜为0.20 mg/kg0.25 mg/kg。4.2 配种 供体羊撤栓后12 h36 h进行发情鉴定，发情母羊进行本交或人工授精，发情鉴定和人工授精方法按DB53/T760.2要求执行。5 胚胎回收（冲胚）5.1 时间 供体羊发情后第一次配种或输精当日为0 d，在第2 d3 d或6 d7 d用手术法分别从输卵管或子宫角回收胚胎，母羊回收胚胎前禁食24 h，禁水12 h。5.2 冲胚方法 5.2.1 输卵管法 操作方法按NY/T 826执行。5.2.2 子宫法 子宫法冲胚按照以下步骤和要求进行：a)按 NY/T 826 规定准备药品、器材、配制冲胚液，也可以使用外购的专用冲胚液；b)将供体羊仰卧于手术保定架上，按每公斤体重静脉注射 0.02 mL0.03 mL 2%静松灵麻醉；c)手术部位一般选择乳房前腹中线部，剪去术部毛，刮净毛茬，分别用清水和消毒液清洗，然后由里向外涂以 2%4%的碘酒，待干后再用 75%的酒精棉脱碘；d)盖上创巾，使预定的切口部位暴露在创巾开口的中部。按皮肤、皮下组织、肌肉、腹膜的顺序切口，然后将食指及中指由切口伸入腹腔，在骨盆腔、膀胱周围触摸子宫，并将子宫、卵巢引出切口外，记录两侧卵巢黄体和卵泡数；e)用小号止血钳在子宫体基部打孔，将冲卵管插入，依据羊只发情到冲胚当天时间间隔，使气球在子宫角中部，冲卵管尖端靠近子宫角前端；f)使用 5 mL 一次性注射器缓慢注入 3 mL4 mL 气体，冲卵管另一端接大平皿；g)用套管针在子宫角细部无血管处插入，外接抽取 25 mL 37 冲胚液的注射器，一只手的手指在套管针头后方捏紧子宫角细部，另一只手推注射器，缓慢平稳的注入液体，使液体顺畅地从冲卵管流入大平皿中待检；h)冲完后气球放气，抽出冲卵管和套管针，用同样方法回收另一侧胚胎。6 胚胎质量鉴定 6.1 检胚 检胚按下列要求进行：DB53/T 760.32016 3 a)实验室温度 20 25，检胚者应熟悉体视显微镜的结构和操作，检胚的顺序应由低倍到高倍，一般在 100 倍左右即能发现胚胎，对胚胎鉴定分级时再转向高倍。b)根据胚胎的比重、大小、形态和透明带折光性等特点找胚。胚胎的比重比冲卵液大，一般位于集卵皿的底部；绵羊胚胎直径为 150 m200 m，是一球形体，在光镜下呈圆形，其外层是透明带，镜检找到的胚胎数应和卵巢上黄体数大致相当。c)将检出的胚胎放入盛有保存液的35 mm 培养皿中，冲洗胚胎 3 次5 次，然后把全部胚胎移至另一个培养皿；一只供体羊的胚胎放在同一个皿内。6.2 胚胎的质量鉴定 6.2.1 发育阶段鉴定 在40 倍120 倍的体视显微镜下，对受精卵观察胚胎发育状态、形态轮廓、色泽、卵裂球的大小、均匀度、细胞密度、变性程度以及胚龄与发育期是否相吻合等。超数排卵发情供体羊第一次配种后胚胎发育期划分为下列七个阶段：a)受精卵：第 2 d3 d 从输卵管回收的胚胎，发育阶段为 2 细胞期8 细胞期，可清楚地观察到卵裂球，卵黄腔内空隙较大。b)桑椹胚：第 3 d4 d 回收的胚胎，可以观察到球状的细胞团，分不清卵裂球，细胞团占据卵黄腔的大部分。c)致密桑椹胚：第 4 d5 d 回收的胚胎，细胞团变小，占卵黄的 60%70%。d)早期囊胚：第 5 d6 d 回收的胚胎，细胞团的一部分出现发亮的胚泡团和滋养层。e)囊胚：第 6 d6.5 d 回收的胚胎，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满卵黄腔。f)扩张囊胚：发情后第 6.5 d7.0 d 回收的胚胎，囊腔明显扩大，体积增大到原来的 1.2 倍1.5 倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的 1/3。g)孵化胚：一般在发情后第 7 d8 d，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，胚细胞脱出。6.2.2 质量等级 胚胎质量分为以下四个级别：a)A 级：优质胚。发育正常，胚龄与发育期相吻合，桑椹胚期前胚胎卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂均匀，无变性的细胞。b)B 级：良好胚。发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗稍淡，细胞密度较小或小型卵裂球过多，细胞变性率为 10%20%。c)C 级：一般胚。轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，细胞变性率为 30%40%。d)D 级：不可用胚。未受精卵和变性胚。6.3 记录 供体羊超数排卵和胚胎回收记录参见NY/T 826执行。7 胚胎冷冻保存与解冻 7.1 保存 7.1.1 仪器及材料 DB53/T 760.32016 4 体视显微镜、程序冷冻仪、0.25 mL塑料冷冻细管、培养皿、封口粉、冷冻记号笔等。7.1.2 试剂 冲胚液、以冲胚液为基础液配制的0.5 mol/L乙二醇、1.0 mol/L乙二醇、1.5 mol/L乙二醇、0.5 mol/L蔗糖。7.1.3 冷冻 冷冻按下列顺序进行：a)标记：在 0.25 mL 细管上用冷冻记号笔写上品种、耳号、胚胎数量、发育阶段和质量等级；b)洗涤与平衡：需冷冻胚胎先在冲胚液中洗涤 3 次，再分别在 0.5 mol/L 和 1.0 mol/L 乙二醇中平衡 5 min 后装管；c)装管：用 0.25 mL 细管吸取少量 0.5 mol/L 蔗糖、空气、1.5 mol/L 乙二醇、空气、1.5 mol/L乙二醇并在此段放入已平衡 2 次的胚胎、空气、1.5 mol/L 乙二醇、空气、0.5 mol/L 蔗糖，最后，用封口粉封口；0.25 ml 冷冻细管各段分布图详见图 1：图1 胚胎冷冻保存细管（0.25 ml）装管图 d)冷冻：胚胎放入 1.5 mol/L 乙二醇时开始计时，到 15 分钟时将装好胚胎并封口的细管放入程序冷冻仪中，以-3/min 的速率从室温降至-6.5 并植冰（用沾有液氮的脱脂棉轻触胚胎段两头的冷冻液，诱发细管内冰晶的形成），在此温度下平衡 10 min，再以-0.3/min 的速率降至-35，平衡 10 min 后投入液氮保存，程序图详见图 2；图2 胚胎冷冻过程图 7.2 解冻 解冻按照以下步骤进行：a)从液氮中取出装有胚胎的细管，空气浴 7 s10 s 后 37 水浴 10 s；b)用消毒纸巾擦干细管，再用半干的酒精棉球擦拭细管表面，剪掉细管两端封口；DB53/T 760.32016 5 c)将细管内液体盛放于培养皿中，于体视显微镜下快速检出胚胎后移入 0.5 mol/L 蔗糖缓冲液中平衡 5 min，将乙二醇去除后用冲胚液洗涤 3 次以去除蔗糖。8 胚胎移植 8.1 受体羊选择 受体羊选择应符合以下要求：a)空怀；b)繁殖性能良好、健康，膘情在 7 成以上；c)年龄 1.5 岁5 岁，经观察有两个正常发情周期；d)供、受体羊发情时间差在12 h 内。8.2 受体羊饲养管理 受体羊应按以下要求管理：a)单独组群加强饲养，在移植前 1 个月开始补饲；b)保持饲养环境相对稳定，避免应激反应；c)加强公羊管理，避免偷配。d)新购进受体羊需进行驱虫和综合免疫处理，隔离观察、复膘并适应新环境，发情周期正常后再安排使用。8.3 受体羊同期发情处理 将孕酮硅胶栓（CIDR，孕酮含量为300 mg/个）或海绵栓（孕酮含量为400 mg/个）埋置入母羊阴道，放置15 d后取出，取栓时肌注孕马血清促性腺激素（PMSG）200 IU/只250 IU/只，24 h48 h内观察发情。受体羊发情之日为0 d，按胚龄要求进行移植。8.4 受体羊发情鉴定 受体羊的发情鉴定按DB53/T*.2执行。严格管理发情羊，避免公羊偷配。8.5 移植要求 胚胎移植应满足以下要求：a)根据发情记录判定供体（胚龄）与受体羊的发情时间差，以此确定移植时间，原则上要求供、受体羊发情时间差在12 h 内。b)移植操作前应对受体羊黄体发育情况作出判断，按黄体突出卵巢的直径，将黄体发育程度分为优：0.6 cm1.0 cm、中：0.5 cm、差：小于 0.5 cm，宜在黄体发育中等程度以上进行移植操作，没有黄体不可进行移植操作。c)胚胎移植部位应与供体母羊回收胚胎的部位一致，即输卵管回收的胚胎移植于输卵管，子宫角回收的胚胎移植于子宫角。d)受体羊术前需禁食 24 h、禁水 12 h。8.6 移植操作 8.6.1 手术法 DB53/T 760.32016 6 将受体羊仰卧于手术保定架上，按每公斤体重静脉注射0.01 mL0.02 mL 2%静松灵，手术部位及手术要求执行5.2.2相关规定。a)输卵管移植：将有黄体一侧的输卵管伞部拨开，找到管口，把装有胚胎的移植器从此插入 3 cm4 cm，然后将胚胎轻轻推出即可，操作中不可用力牵拉卵巢，不能触摸黄体。b)子宫移植：将黄体较好一侧的子宫角拉出，避开血管，用曲别针制成的打孔针在子宫角打孔，把装有胚胎的移植器从此孔插入子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可。8.6.2 腹腔内窥镜法 将受体羊仰卧于手术保定架上，按每公斤体重静脉注射0.01 mL0.02 mL 2%静松灵，手术部位及手术要求执行5.2.2相关规定。内窥镜法胚胎移植按照以下步骤进行：a)用手术刀片在腹中线两侧，距乳房 2 cm 处，各切一个 1