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DB22T
2260-2015
鹿鞭鉴定方法
PCR法
2260
2015
鉴定
方法
PCR
ICS 67.120 B 45 备案号:44981-2015 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 22602015 鹿鞭鉴定方法 PCR 法 Identification of Sika Deer and Wapiti Pizzles-Polymerase Chain Reaction Method 2015-02-01 发布 2015-03-01 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 22602015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位:中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人:邢秀梅、吴琼、杨福合、苏伟林、邵元臣、查代明、荣敏、刘华淼、徐佳萍、杨颖、涂剑锋、张铁涛。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 22602015 1 鹿鞭鉴定方法 PCR 法 1 范围 本标准规定了梅花鹿鞭、马鹿鞭(塔河马鹿除外)的 PCR 鉴定方法。本标准适用于梅花鹿鞭、马鹿鞭(塔河马鹿除外)的真伪鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鹿鞭 pizzle 梅花鹿、马鹿的外生殖器,包括阴茎及睾丸。4 原理 针对梅花鹿、马鹿线粒体DNA(mtDNA)的D-loop区特异性基因序列设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增特异性DNA片段,根据是否扩增出特异性片段对鹿鞭进行鉴定。5 试剂和材料 除非另有说明,所有的化学试剂均为分析纯。实验用水规格应符合GB/T 6882中二级水的规定。5.1 引物 上游引物:5-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3 下游引物:5-ATCTAGTGCTCGAATTAATGGTAC-3 5.2 试剂 5.2.1 氯化钠(NaCl),CAS 号 7647-14-5。5.2.2 氯化镁(MgCl26H2O),CAS 号 7791-18-6。5.2.3 氢氧化钠(NaOH),CAS 号 1310-73-2。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 22602015 2 5.2.4 琼脂糖,CAS 号 9012-36-6。5.2.5 三羟甲基氨基甲烷(Tris),CAS 号 77-86-1。5.2.6 十二烷基磺酸钠(SDS),CAS 号 2386-53-0。5.2.7 乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA),CAS 号 15708-41-5。5.2.8 盐酸(HCl),CAS 号 7647-01-0。5.2.9 三氯甲烷(氯仿),CAS 号 67-66-3。5.2.10 冰乙酸,CAS 号 64-19-7。5.2.11 无水乙醇,CAS 号 64-17-5。5.2.12 Tris 饱和酚,CAS 号 108-95-2。5.2.13 Triton X-100,CAS 号 9036-19-5。5.2.14 75%乙醇。5.2.15 酚氯仿混合液(体积比 11):Tris 饱和酚、氯仿等体积混合,置于棕色瓶中,4保存。5.2.16 dNTP 溶液(市售):含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP,各 2.5 mmol/L。5.2.17 10PCR Buffer 缓冲液(不含氯化镁)(市售):100 mmol/L KCl,160 mmol/L(NH4)2SO4,20 mmol/L MgSO4,200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1%TritonX-100,1 mg/mL BSA。5.2.18 Taq DNA 聚合酶(5 U/L)。5.2.19 溴化乙锭(10 mg/ml):称量 100 mg 溴化乙锭溶解于 10 mL 水中,然后分装成 1 mL/份,4 避光保存。5.2.20 10 mM Tris:称量 24.22 g Tris 溶于 160 ml 蒸馏水中,加浓 HCL 调 pH 至 8.0,最后定容至200 mL,常温保存。5.2.21 0.5 mol/l EDTA:称量 186.1 g EDTA 溶于 800 mL 蒸馏水中,加 NaOH 调 pH 至 8.0,最后定容至 1000mL,高压灭菌后,常温保存。5.2.22 10%SDS:称量 10.0 g SDS 溶于 100 mL 蒸馏水中,55 水浴锅中助溶。5.2.23 20 mg/mL 蛋白酶 K:称量 100.0 mg 蛋白酶 K 溶于 5 ml 无菌去离子水(ddH2O)中,分装成 1 mL/份,-20 保存。5.2.24 50TAE:称量 242.0 g Tris 溶于 700 mL 蒸馏水中,加入 57.1 mL 冰乙酸,100 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)后定容至 1000 mL,使用时 50 倍稀释。5.2.25 细胞裂解液:0.5%SDS,0.5%Triton X-100,10 mM Tris pH 7.6,10 mM Na2EDTA,8 mM MgCl2,8mM NaCl。5.2.26 DNA 分子量标准:DL 2000。5.2.27 6loading Buffer(市售):含 0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青 FF,30%甘油水溶液,4 保存。6 仪器 6.1 PCR 仪。6.2 紫外分光光度计。6.3 电泳仪。6.4 凝胶成像系统。6.5 离心机:离心力12000 g。6.6 微量可调移液器:0.2 L2 L,2 L20 L,20 L200 L,100 L1000 L。6.7 涡旋振荡器。6.8 电子天平:感量 0.0001 g 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 22602015 3 6.9 恒温水浴锅。7 试样制备 新鲜、烘干或加工后鹿鞭样品,每个样品采集阴茎前段、中段及睾丸各选取2个点,每个点采集0.5 cm3的样品,在液氮下研磨成粉末状,放入冻存管中,-80 保存。8 分析步骤 8.1 提取 DNA 8.1.1 取处理后的试样约 50 mg,放入 1.5 mL 离心管中,加入 500 L 细胞裂解液(5.2.25)摇匀,加入 10 L 蛋白酶 K,充分混匀后放入 55 水浴中温和振荡,消化过夜。8.1.2 加入等体积的 Tris 饱和酚,颠倒混匀离心,上清液转入新的离心管中,重复 2 次。8.1.3 上清液加入等体积的酚和氯仿的混合液(11),缓慢混匀 10 min,4 12000 r/min 离心 5 min,吸取上清。8.1.4 上清液中加入等体积的氯仿,颠倒混匀,4 12000 r/min 离心 5 min,吸取上清。8.1.5 加入 2 倍体积的冰乙醇,混匀,4 12000 r/min 离心 10 min,弃上清液。8.1.6 加入 75%乙醇 500 L,4 12000 r/min 离心 10 min,弃上清,沉淀核酸。8.1.7 在 65 烘箱中干燥 5 min;8.1.8 加入 100 L 超纯水,溶解,-20 保存。注:也可用DNA提取试剂盒提取,按照试剂盒操作说明书指示进行操作。8.2 PCR 检测 8.2.1 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1,同时设置阴性对照(无菌水)。表1 PCR 反应体系 成分 用量/(L)10 Buffer 2.5 dNTP/(2.5 mM)3.0 上游引物/(10 M)0.5 下游引物/(10 M)0.5 Taq酶/(5 U/L)0.5 DNA 模板 1.5 ddH2O 16.5 注:按照上述试剂顺序逐项加样至0.2 mL的PCR反应管中,混匀后瞬离。8.2.2 PCR 反应程序 预变性95 C,10 min;循环扩增94,1 min,56,50 s,72,1 min,30个循环;延伸72,10 min。4 保存。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 22602015 4 8.2.3 扩增产物电泳 用1TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板(溴化乙锭终浓度0.5 g/mL)。将平板放入水平电泳槽中,加入1TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面,将PCR扩增产物6 L与1 L上样缓冲液混合,分别加入样品孔中,取5 L DNA Marker DL 2000加入到标准分子量对照孔内。5 V/cm恒压电泳30 min-45 min。凝胶成像系统下观察并分析。9 结果判定 若待检样品出现306 bp或307 bp特异性片段,即判定为梅花鹿或马鹿鹿鞭。必要时取PCR扩增产物进行测序,如果结果与附录A参考序列比较,序列相似性在95%以上,可进一步确认待测样品结果为阳性。10 废弃物处理和防止污染的措施 10.1 检测过程中的废弃物需经 121 高压灭菌处理至少 30 min。10.2 检测过程中防止交叉污染的措施见 WS/T 230-2002 中第六章规定执行污染的预防和控制规定。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 22602015 5 A A 附 录 A(资料性附录)梅花鹿、马鹿的特征性序列 A.1 梅花鹿特异扩增片段序列(307bp):ACAAAGCACGTGATATAACCTTATGTGTTTGTAGTACATAAAATTAATGCATTAAGGCACACATGTACAATGGTACATAAAATCGGTGTATAGGACATATTATGCATAATAGTACATAAATTAATGTATTAGGACATACTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATTTTCTATTATCTACAGTACATAGTACATGATGTTGCTTATCGTACATAGCGCATTGAGTCAAATCAGTCCTCGTCAGCATGCGTATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTGATCACCATG A.2 马鹿特异扩增片段序列(306bp):GCAAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAAATCAATGTACTAGGACATGCATGTATAACAGTACATAAGTTAGCGTATAGGACATATTATGTATAATAGTACATAAATTAATGTATCAGGACATATTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTACTTTCTACTATCTAAAGTACATAGTACATAATGTTGTTCATCGTACATAGTACATTAAGTCAAATCAGTCCTTGTCAACATGCGTATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATTACCATG _ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印