DB13T 2894-2018 动物尿液中苯乙醇胺A的测定酶联免疫吸附法.pdf

ICS 11.220 B 42 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 28942018 动物尿液中苯乙醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 2018-12-13 发布 2018-12-31 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB13/T 28942018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由河北省农业厅提出。本标准起草单位：河北省科学院生物研究所、河北省兽药监察所、石家庄市畜产品质量监测中心。本标准主要起草人：李春生、米振杰、李云、刘静静、赵义良、杜顺丰、吴萌、王振来、张静。DB13/T 28942018 1 动物尿液中苯乙醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物尿液中苯乙醇胺A的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品处理、测定、结果计算、检出限、准确度、精密度、确证试验等要求。本标准适用于动物尿液中苯乙醇胺A的快速筛查。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法 GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则 NY/T 3146 动物尿液中22种-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 3 原理 采用酶联免疫吸附法，在微孔条上包被偶联抗原，样本中的苯乙醇胺A与酶标板上的偶联抗原竞争苯乙醇胺A抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450 nm处测定吸光度，吸光度值与苯乙醇胺A含量成负相关，与标准曲线比较即可得出苯乙醇胺A含量。4 试剂和材料 以下所有的试剂，除特别注明外均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的二级水。4.1 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒：应符合 GB/T 33411 的规定，组成见附录 A。4.2 乙酸铵。4.3 乙酸。4.4 氢氧化钠。4.5 乙酸乙酯。4.6 氯化钠。4.7 -盐酸葡萄糖醛苷酶。4.8 芳基硫酸酯酶。4.9 苯乙醇胺 A 标准品。DB13/T 28942018 2 4.10 乙酸铵缓冲液(2 mol/L)：称取乙酸铵 15.4 g，溶解于 1000 mL 水中，用适量乙酸调 pH 至 5.2。4.11 氢氧化钠溶液(5 mol/L)：称取氢氧化钠 2 g，溶解于 10 mL 水中。4.12 -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶：-盐酸葡萄糖醛苷酶活性约 30 U/mL；芳基硫酸酯酶活性约 60 U/mL。5 仪器和设备 5.1 分析天平：感量 0.1 g。5.2 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。5.3 离心机：10 000 rpm。5.4 旋涡混合器。5.5 恒温箱。5.6 电热恒温振荡水槽。5.7 氮吹仪。5.8 pH 计。5.9 微量移液器：50 L，100 L，200 L，1 000 L。5.10 八道移液器：250 L。6 样品处理 6.1 样品制备 动物尿液试样使用前放置室温，如有混浊，离心后取上清液备用，4保存。6.2 酶解 准确量取5.0 mL试样（6.1）于50 mL离心管，加入乙酸铵缓冲液（4.10）0.5 mL，再加入-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（4.12）50 L，旋涡混匀，于37下避光水浴振荡16 h。6.3 提取 酶解后，用氢氧化钠溶液（4.11）调pH至9.80.2，加入乙酸乙酯（4.5）10 mL，再加入固体氯化钠（4.6）1.5 g2 g饱和水相，旋涡混匀，10 000 rpm离心5 min，取上清液于另一50 mL离心管内。再用乙酸乙酯10 mL重复提取一次。合并上清液，50下氮气吹干，用乙酸铵溶液（4.10）5 mL溶解。取100 L定容液加入200 L样本稀释液，混匀后备用。7 测定 7.1 使用前将试剂盒在室温下回温 1 h2 h，将所需的酶标板条插入板架中。DB13/T 28942018 3 7.2 每孔依次加标准品或试样 50 L，再加抗体工作液 50 L，轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板，置37 下反应 45 min。7.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，完全除去孔中的液体，每孔加 250 L 洗涤液，5 s 后倒掉孔中液体，拍干，重复洗涤三遍。7.4 每孔加酶标记抗体工作液 100 L。用盖板膜盖板，置 37 下反应 30 min，重复 7.3。7.5 底物液 A 液和 B 液按体积比 11 混匀后，每孔加 100 L，37下避光显色 15 min。7.6 每孔加终止液 50 L，轻轻振荡混匀，放入酶标仪，450 nm 波长测定吸光度值。8 结果计算 按公式（1）计算百分吸光度比值：%1000BBY（1）式中：Y百分吸光度比值；B标准溶液或试样溶液的平均吸光度值；B0空白（零浓度的标准溶液）的平均吸光度值。以百分吸光度比值为纵坐标，以苯乙醇胺A标准品浓度（g/L）的对数（lg）为横坐标，绘制标准曲线。将试样的百分吸光度比值代入标准曲线，计算出溶液的浓度，试样中苯乙醇胺A的浓度（g/L）按照公式（2）计算。VNcVX1（2）式中：X试样中的苯乙醇胺A的含量，单位为微克每升（g/L）；c从标准曲线上得到的待测溶液中苯乙醇胺A的浓度，单位为微克每升（g/L）；V1试样提取溶液体积，单位为毫升（mL）；N试样稀释倍数；V试样的体积，单位为毫升（mL）。9 检出限、准确度、精密度 9.1 检出限 本方法的检出限为0.2 g/L。9.2 准确度 本方法在0.2 g/L2 g/L添加浓度水平上的回收率为80%120%。9.3 精密度 本方法在0.2 g/L2 g/L浓度范围的添加回收实验，批内变异系数应20%。DB13/T 28942018 4 10 确证试验 如被测样品中检出苯乙醇胺A时，需要用质谱方法进行确证。DB13/T 28942018 5 附 录 A（资料性附录）苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒组成 A.1 酶标板：规格为 12 条8 孔。A.2 苯乙醇胺 A 系列标准溶液：0 g/L、0.1 g/L、0.3 g/L、0.9 g/L、2.7 g/L、8.1 g/L。A.3 抗体工作液。A.4 酶标记抗体工作液。A.5 浓缩样本稀释液：使用前按说明书配制。A.6 浓缩洗涤液：使用前按说明书配制。A.7 底物液 A 液。A.8 底物液 B 液。A.9 终止液。