DB22T 1609-2012 动物尿液中β-受体激动剂测定酶联免疫法.pdf

ICS 67.050 X 04 备案号：35743-2013 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 16092012 动物尿液中-受体激动剂测定 酶联免疫法 Determination of-Agonists in animal urine Enzyme linkde immunosorbent assay 2012-12-01 发布 2013-01-01 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16092012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、珲春出入境检验检疫局、白城出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡婷婷、李玲、张琦、杨帆、张勋、杨璐、冯博。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16092012 1 动物尿液中-受体激动剂测定 酶联免疫法 1 范围 本标准规定了动物尿液中-受体激动剂残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于动物尿液中克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗、马喷特罗、特布他林及卡布特罗残留定性的快速筛查。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理 检测的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对沙丁胺醇抗体的捕获抗体。加入沙丁胺醇抗体后，会与捕获抗体结合。经过孵育及洗板步骤后，加入标准品、样品溶液及沙丁胺醇酶标记物（酶连接物），样品中的-受体激动剂与沙丁胺醇酶连接物竞争沙丁胺醇抗体的连接位点（竞争性酶联免疫法）没有连接的沙丁胺醇酶连接物在洗涤步骤中被除去。将底物/发色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶连接物将发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450 nm处测量，吸光度值与样品中的-受体激动剂浓度成反比。几种待测物交叉反应率应不低于50%。4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 氢氧化钠（NaOH）。4.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.3 正己烷（C6H14）：色谱纯。4.4 盐酸（HCl）。4.5-受体激动剂检测试剂盒：应在有效期内使用，保存于 2 8。不同批次的试剂盒不可混用。4.5.1-受体激动剂系列标准溶液：浓度依试剂盒要求确定。4.5.2 酶标板。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16092012 2 4.5.3 抗体。4.5.4 酶标记物。4.5.5 底物/发色剂。4.5.6 反应终止液。4.5.7 样品稀释缓冲液。4.5.8 洗涤缓冲液。5 仪器与设备 5.1 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。5.2 微量加液器：单道 20 L200 L，200 L1000 L 微量加液器，多道 50 L250 L 微量加液器。5.3 振荡器。5.4 涡旋振荡器。5.5 天平：感量为 0.01 g。5.6 高速离心机。6 分析步骤 6.1 试样处理 取20 L尿液样品直接进行检测，如果尿液混浊，试验前先进行离心或过滤。6.2 测定步骤 6.2.1 制备酶标记物和抗体使用液：1：10 稀释酶标记物和抗体，如取 200 L 酶标记物及 2 mL 样品稀释缓冲液（4.5.7）稀释并混合均匀。6.2.2 依次向微孔中加入稀释后的酶标记物 10 L，室温下孵育 15 min。6.2.3 倒出孔中液体，每孔加入洗涤缓冲液（4.5.8）250 L，弃去孔中液体，再将酶联板倒置在滤纸上拍打，重复洗板 3 次。6.2.4 加入标准溶液或试样溶液 20 L，然后加入 100 L 稀释后的酶标记物（6.2.1），用手轻摇微孔板混合，在室温（20 25）孵育 30 min。6.2.5 弃去孔中液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。每孔加入洗涤缓冲液（4.5.8）250 L，弃去孔中液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板 3 次。6.2.6 加入 100 L 底物/发色剂（4.5.5）到各微孔中，用手轻轻摇动微孔板混合，在室温（20 25）下暗处孵育 15 min。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 16092012 3 6.2.7 加入 100 L 反应终止液（4.5.6），在 450 nm 处测定吸光度值。7 结果计算和表述 7.1 计算相对吸光度值 分别计算标准和样品的平均吸光值。按式（1）计算标准液和样液的相对吸光度值。%1000=BBX（1）式中：X 相对吸光度值；B 标准液或样液的平均吸光度值；B0 0 g/L标准液的平均吸光度值。7.2 绘制标准曲线 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值（log 10）为横坐标绘制标准曲线。每次试验均需重新绘制标准曲线。7.3 样品结果计算 通过标准曲线可以计算出样品的浓度值；样品的-受体激动剂残留物的总量按式（2）计算：nCX=（2）式中：X 样品待测组分的量，单位为微克每千克（g/kg）；C 样品待测组分的浓度；n 稀释倍数。8 结果处理 阳性样品须用液相色谱质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）确证。9 筛查浓度范围 本方法的-受体激动剂残留量的筛查范围为0.3 g/kg16.2 g/kg。_ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印