连翘酯苷A对肝星状细胞增殖及凋亡的影响.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期287网络出版地址：https：/ 基础医学院（成都 610500）；2.成都医学院第一附属医院（成都 610500）；3.雅安市名山区人民医院（雅安 625000）【摘要】目的研究连翘酯苷A（FA）对肝星状细胞增殖活化及凋亡的影响。方法以人肝星状细胞（LX-2）作为实验对象，采用血小板衍生生长因子（PDGF）-BB模拟肝纤维化微环境，实验分为对照组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LX-2细胞活力；采用油红O检测细胞内脂滴的情况；采用免疫荧光染色检测细胞内平滑肌肌动蛋白（-SMA）的表达；采用蛋白质印迹技术（Western Blot）检测纤维化相关标志蛋白-SMA、1-I型胶原蛋白（COL1A1）和凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2蛋白（BCL-2）、剪切的-腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）、BCL-2相关X蛋白（BAX）、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cleaved-CASPASE-3）的表达；采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果FA处理后LX-2细胞活力明显下降，且呈剂量依赖性；油红O实验结 果显示，与PDGF-BB组比较，FA组细胞内脂滴数量较多；免疫荧光染色结 果显示，与PDGF-BB组相比，FA组细胞内-SMA荧光斑点的数量减少；Western Blot实验结 果显示，FA组-SMA、COL1A1、BCL-2蛋白表达减少，cleaved-PARP、BAX、cleaved-CASPASE-3蛋白表达增加。结论FA可抑制肝星状细胞的增殖、活化，促进凋亡，改善PDGF-BB诱导的体外肝纤维化。【关键词】凋亡；肝纤维化；肝星状细胞；连翘酯苷A【中图分类号】R34【文献标识码】AEffects of Forsythiaside A on Proliferation and Apoptosis of Hepatic Stellate CellsLiu Rong1，Tang Bin2，Liu Yilun3，Tan Yuehao1，Li Can1，Hu Xue1，Shen Haotian1，Deng Fengmei1.1.School of Basic Medical Sciences，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；3.Peoples Hospital of Mingshan District，Yaan 625000，China【Abstract】ObjectiveTo study the effects of forsythiaside A（FA）on the proliferation，activation and apoptosis of hepatic stellate cells（HSCs）.MethodsHuman HSCs（LX-2）were used as the model.And platelet derived growth factor（PDGF）-BB was used to simulate the microenvironment of liver fibrosis.LX-2 cells were divided into control group，PDGF-BB group，FA group and PDGF-BB+FA group and received corresponding treatment.The activity of LX-2 cells was detected by cell counting kit-8（CCK-8）.The lipid droplets in cells were detected by oil red O.The protein expression of smooth muscle actin（-SMA）in cells was detected by immunofluorescence staining.The expressions of fibrosis-related marker proteins-SMA，and collagen type I alpha1（COL1A1）and apoptosis-related proteins B-cell lymphoma-2（BCL-2），cleaved poly ADP-ribose polymerase（cleaved-PARP），BCL-2-associated X protein（BAX），and cleaved cysteine aspartate proteinase 3（cleaved-Caspase-3）were detected by Western Blot.The cell apoptosis was detected by flow cytometry.ResultsThe activity of FA treated LX-2 cells decreased in a dose-dependent manner.Oil red O experiment showed that compared with PDGF-BB treatment，FA treatment up-regulated the number of lipid droplets in cells.Immunofluorescence results showed that compared with PDGF-BB treatment，FA treatment down-regulated the number of-SMA fluorescence spots in cells.Western Blot results showed that FA treatment down-regulated the protein expression of-SMA，COL1A1 and BCL-2，and up-regulated the protein expression of cleaved-PARP，BAX，and cleaved-Caspase-3.ConclusionFA can inhibit the proliferation and activation of HSCs，promote their apoptosis，and improve the in vitro liver fibrosis induced by PDGF-BB.【Key words】Apoptosis；Liver fibrosis；Hepatic stellate cells；Forsythiaside A*基金项目：四川省中医药管理局科研项目（No：2021MS101）；四川养老与老年健康协同创新中心科研项目（No：YLZBZ2021）；成都医学院研究生创新基金（No：YCX2022-01-04）通信作者：邓峰美Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期288肝纤维化是肝硬化和肝癌的必经阶段，由肝内结缔组织异常增生形成。病毒性肝炎、酒精性或肥胖相关的脂肪性肝炎、寄生虫病、代谢性疾病、自身免疫性肝病等均可引起慢性肝损伤，导致肝脏炎症和纤维化1。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）驻留在血管内皮下间隙，在各种损伤因素下可被激活，使之活化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，从而产生瘢痕组织2。在肝脏疾病中，HSCs的激活是肝纤维化发展的关键步骤。在生理情况下，HSCs处于静息状态；当受到各种损伤因素刺激时，肝脏中的细胞（肝细胞、枯否细胞等）释放大量细胞因子作用于静止状态的HSCs，使其活化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是以表达丰富的细胞内蛋白为特征，包括波形蛋白、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，-SMA）和1-型胶原蛋白（collagen typealpha1，COL1A1）等，而ECM的主要成分又是I型胶原蛋白，实验中常把-SMA和COL1A1蛋白作为体外肝纤维化的标志物3。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是肝脏中关键的有丝分裂原，可激活HSCs4-5，增加-SMA的表达，而PDGF-BB是其中最强的丝裂原，因此在实验中常采用PDGF-BB来激活HSCs，模拟体内肝纤维化微环境。细胞凋亡、坏死和自噬性死亡均会触发细胞死亡6，可 作 为 介 导HSCs的 靶 点。研 究7表 明，抑 制HSCs增殖、激活或诱导HSCs衰老和凋亡，阻断ECM的过度沉积，可有效改善肝纤维化8-9。慢性肝损伤后，肝细胞发生凋亡，导致HSCs活化、增殖并导致炎症和纤维化反应，因此抑制肝细胞凋亡被认为是肝纤维化治疗的重要策略10。长期肝损伤引起的肝纤维化和肝硬化是全球卫生保健的主要负担之一，迄今为止，肝移植仍然是失代偿性肝病的主要治疗方法11。近年来随着肝病发病率的逐年上升，急需研发高效、毒性较小的新药物，中药因作用靶点多、副作用小、毒性低等特点备受关注。连翘酯苷A（forsythiaside A，FA）是从连翘的风干果实中分离出来的一种苯乙醇苷类物质，具有多种生物学功能，如抗炎12、抗氧化13、抗病毒感染14等。近年来研究15发现，FA具有保肝作用，FA可通过PI3K/AKT介导细胞凋亡，改善乙酰氨基酚诱导的斑马鱼肝损伤；FA通过调节肠道微生物组群从而减轻四氯化碳诱导的肝纤维化16。FA可预防过氧化氢诱导的线粒体依赖性PC12细胞凋亡17。FA还可通过抗炎和抗凋亡作用改善脓毒症诱导的急性肾损伤18。目前，FA对LX-2细胞凋亡及改善肝纤维化的作用机制尚未完全阐明，因此本研究拟探索FA对人肝星状细胞增殖活化及凋亡的作用，现报道如下。1材料与方法1.1细胞采用人源肝星状细胞（LX-2）为实验对象，LX-2细胞株购自武汉普诺塞公司，于无菌培养箱中培养（37、5 CO2）。每天观察细胞密度及形态，待培养基颜色发生变化时更换细胞培养液，后续进行油红O染色、蛋白质印迹技术等实验。1.2主要试剂杜氏改良高糖培养基（货号：11965092）、胎牛血清（货号：10100147）、0.25胰蛋白酶（货号：25200072）、青链霉素双抗（货号：15070063）购自美国Gibco公司；FA（货号：HY-N0028）、PDGF-BB（货号：HY-P7055）购 自 美 国MCE公 司；4，6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（货号：C1002）、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（货号：A0423）购自北京碧云天生物技术有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（货号：CA1020）、油红O染色试剂盒（货号：G1262）购自北京索莱宝公司；兔多克隆抗体-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）（货号：19245）、1-I型 胶 原 蛋 白（collagen type I alpha1，COL1A1）（货号：72026）、腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（货号：9532）、B淋巴细胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）（货号：4223）、B