鲢和青鱼转谷氨酰胺酶诱导下肌球蛋白凝胶特性的研究_易林.pdf

第42卷 第4期2023年 7月华中农业大学学报Journal of Huazhong Agricultural UniversityVol.42 No.4July 2023，254261鲢和青鱼转谷氨酰胺酶诱导下肌球蛋白凝胶特性的研究易林，安玥琦，张晗玮，熊善柏华中农业大学食品科学技术学院/国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心（武汉）/长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，武汉 430070 摘要 为探究不同品种淡水鱼转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）对肌球蛋白凝胶特性的影响，以鲢和青鱼肌球蛋白为试验对象，分别测定鲢转谷氨酰胺酶（silver carp transglutaminase，STG）和青鱼转谷氨酰胺酶（black carp transglutaminase，BTG）作用下肌球蛋白在低温凝胶化后溶解度、蛋白聚集、流变学特性、穿刺特性和微观形貌的变化。结果显示：与未加酶组相比，添加2种TGase后均可催化鲢或青鱼肌球蛋白交联形成更多的-（-Glu）-Lys异肽键，导致肌球蛋白重链（myosin heveay chain，MHC）的聚集程度增加，蛋白浊度值及平均粒径显著增大（P0.05），肌球蛋白凝胶的弹性模量（G）明显增大，凝胶破断力和破断距离显著提升（P0.05），蛋白网络结构增强。在提升同种肌球蛋白凝胶特性方面，BTG 的催化交联作用强于 STG；而 BTG 的比酶活（12.67 U/mg）低于STG的比酶活（14.34 U/mg），且无论是否添加TGase，青鱼肌球蛋白的凝胶特性始终高于鲢肌球蛋白。综上，不同品种淡水鱼糜凝胶特性的差异并非主要由TGase的活性差异所导致，而与其肌球蛋白的来源密切相关。关键词 转谷氨酰胺酶；肌球蛋白；凝胶特性；流变学特性；凝胶网络结构中图分类号 TS254.4 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2023）04-0254-08我国淡水渔业资源丰富，2021年淡水鱼养殖产量高达2 640.28万t，位居世界第一1。渔业生产快速增长的同时也带动了淡水鱼糜制品产业的发展，鲢、草鱼、青鱼等低值淡水鱼成为鱼糜及鱼糜制品加工的重要原料。然而，不同品种淡水鱼糜凝胶特性差异显著，肉食性青鱼鱼糜的凝胶形成能力要优于鲢、草鱼等滤食性或草食性鱼类。这与鱼糜凝胶化阶段，内源性转谷氨酰胺酶（TGase）诱导的肌球蛋白交联反应密切相关。Araki等2研究发现鲤TGase对不同鱼类肌球蛋白聚合速率的影响差异显著。Binsi等3试验发现不同海水鱼 TGase作用下，比目鱼肌球蛋白凝胶强度、肌球蛋白重链（MHC）聚集程度与TGase的活性呈正相关。贾丹4在对比7种淡水鱼糜的化学组成和凝胶特性的研究中也有类似发现，鱼糜的谷氨酸和赖氨酸含量、TGase活性与鱼糜凝胶强度密切相关。但有关青鱼与其他淡水鱼TGase对肌球蛋白凝胶特性的作用差异鲜有报道，且不同品种淡水鱼糜凝胶特性的差异是否主要由TGase活性差异或肌球蛋白来源导致的，目前尚不清楚。因此，本研究以鲢和青鱼肌球蛋白为对象，分析在鲢转谷氨酰胺酶（STG）和青鱼转谷氨酰胺酶（BTG）作用下肌球蛋白凝胶化后溶解度、蛋白聚集、流变学特性、穿刺特性和微观形貌的变化及差异，以明确不同品种淡水鱼糜的凝胶特性存在差异的原因，旨在为淡水鱼糜凝胶的品质调控提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料新鲜鲢（约2 kg/尾）、青鱼（约4 kg/尾）购于华中农业大学校内农贸市场，将其放置在水箱中保活运至实验室后，于低温间宰杀，取鱼背部白肉备用。牛血清蛋白、N，N-二甲基酪蛋白（DMC）、丹酰尸收稿日期：2023 05 29基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-45-28）易林，E-mail：通信作者：熊善柏，E-mail：易林，安玥琦，张晗玮，等.鲢和青鱼转谷氨酰胺酶诱导下肌球蛋白凝胶特性的研究 J.华中农业大学学报，2023，42（4）：254261.DOI：10.13300/ki.hnlkxb.2023.04.029胺等分析纯试剂购于美国Sigma-Aldrich公司；三羧甲基氨基甲烷（Tris）、碳酸钠、酒石酸钾钠、五水硫酸铜、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、盐酸、氯化钾、醋酸镁、碳酸氢钾、氯化镁、十二烷基硫酸钠（SDS）、三氯乙酸（TCA）、尿素、氢氧化钠、叠氮钠、ATP二钠盐（ATP-Na2）等分析纯试剂购于国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸、蛋白质上样缓冲液、次高分子标准蛋白（Marker）均为电泳纯，购于Biosharp公司；考马斯亮蓝R-250、-巯基乙醇，购于美国Amresco公司。1.2主要仪器K600（3205）型食品料理机，德国博朗公司；AvantiJ-2型高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；T80高速分散均质机，德国IKT公司；UV-1750型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；F-4600型荧光光度计，日本日立公司；AKTA pure L蛋白多糖分离纯化系统，美国思拓凡公司；AR2000ex动态流变仪，美国TA公司；JSM-6390LV 场发射扫描电子显微镜，天美（中国）科学仪器有限公司；DYY-6C电泳仪，美国Bio-Rad公司；NanoZs纳米粒度电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；TA-XT Plus物性分析仪，英国Stable Micro System公司。1.3TGase的制备及酶活测定以 1 10 料液比将鱼肉与缓冲液（20 mmol/L Tris、5 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT、0.01%NaN3混合，pH 7.5）混合，斩拌破碎为鱼浆，8 000 r/min均质 2 min，低温振荡 30 min后离心，取上清液，沉淀以1 10的料液比复溶，进行二次提取，合并2次提取的上清液即为TGase粗酶液。TGase粗酶液的纯化参考Zhang 等5的方法并稍作修改，将鲢和青鱼 TGase 粗酶液经 80%的（NH4）2SO4盐析，透析脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩后，取 5 mL 盐析液依次过 Q-Sepharose FF、Sephacryl S-200 HR层析柱，收集酶活组分即为纯酶液，4 低温贮藏备用。TGase 的活性测定参考 Hemung 等6和 Worratao等7的方法，测得STG和BTG的比酶活分别为14.34、12.67 U/mg。1.4肌球蛋白的提取参考高霞等8的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白浓度测定采用Lowry法9，以牛血清蛋白为标准品制作标准曲线。1.5不同TGase作用下肌球蛋白样品的制备参考魏莉10的方法并稍作修改，用缓冲液（20 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl）将总钙离子浓度调整到40 mmol/L，BTG和STG添加量为10 U/mg蛋白，肌球蛋白浓度要求见具体的测试指标，以不添加TGase的鲢和青鱼肌球蛋白为空白组。若仅流变学测试样品则不单独进行加热处理，TGase加入肌球蛋白后立即进行升温流变测试，其余指标样品均采取40、60 min加热处理，待样品冷却后立即进行测试。1.6凝胶溶解度的测定肌球蛋白质量浓度调整至20 mg/mL，参考Benjakul等11的方法测定凝胶样品溶解度。凝胶溶解度可反映肌球蛋白在低温凝胶化过程中-（-Glu）-Lys异肽键的形成。1.7浊度的测定肌球蛋白质量浓度调整至1 mg/mL，测定加热后样品在320 nm处的吸光值，即为样品的浊度。浊度可反映蛋白质的聚集行为。1.8粒径分布与平均粒径测定采用动态光散射测定肌球蛋白溶液中微粒的大小与分布，以量化肌球蛋白凝胶化后的聚集程度。将肌球蛋白质量浓度调整至 0.2 mg/mL，参考 Wei等12的方法，采用NanoZs纳米粒度电位分析仪测定肌球蛋白的粒径分布与平均粒径。1.9SDS-PAGE实验肌球蛋白质量浓度调整为20 mg/mL，参考贾丹等13的方法，并稍作修改。取 1 g凝胶与 9 mL 5%SDS混合均质，于85 水浴1 h，离心取上清液。将上清液的蛋白质量浓度调整至2 mg/mL，以4 1比例与还原型上样缓冲液混合后，95 金属浴5 min，冷却后用于上样，上样体积为10 L。SDS-PAGE可反映TGase对肌球蛋白组分的影响。1.10动态流变学特性的测定鱼糜凝胶形成过程中的黏弹性可以通过弹性模量G和损耗因子tan表征。肌球蛋白质量浓度调整至20 mg/mL，参考Xue等14的方法并稍作修改。采用AR2000ex动态流变仪测定2090 升温过程中样品G和tan 的变化，升温速率为2/min。1.11穿刺特性的测定肌球蛋白的质量浓度调整为20 mg/mL，参考程梦颖等15的方法并略作修改。将冷却后的凝胶切成高度为20 mm的圆柱体，用TA-XTPlus 的P/0.25S 探头进行破断测试，压缩距离设为10 mm，每个样品做46个平行测定，测试过程中的最大力即为破断第 4 期易林 等：鲢和青鱼转谷氨酰胺酶诱导下肌球蛋白凝胶特性的研究胺等分析纯试剂购于美国Sigma-Aldrich公司；三羧甲基氨基甲烷（Tris）、碳酸钠、酒石酸钾钠、五水硫酸铜、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、盐酸、氯化钾、醋酸镁、碳酸氢钾、氯化镁、十二烷基硫酸钠（SDS）、三氯乙酸（TCA）、尿素、氢氧化钠、叠氮钠、ATP二钠盐（ATP-Na2）等分析纯试剂购于国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸、蛋白质上样缓冲液、次高分子标准蛋白（Marker）均为电泳纯，购于Biosharp公司；考马斯亮蓝R-250、-巯基乙醇，购于美国Amresco公司。1.2主要仪器K600（3205）型食品料理机，德国博朗公司；AvantiJ-2型高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；T80高速分散均质机，德国IKT公司；UV-1750型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；F-4600型荧光光度计，日本日立公司；AKTA pure L蛋白多糖分离纯化系统，美国思拓凡公司；AR2000ex动态流变仪，美国TA公司；JSM-6390LV场发射扫描电子显微镜，天美（中国）科学仪器有限公司；DYY-6C电泳仪，美国Bio-Rad公司；NanoZs纳米粒度电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；TA-XT Plus物性分析仪，英国Stable Micro System公司。1.3TGase的制备及酶活测定以 1 10 料液比将鱼肉与缓冲液（20 mmol/L Tris、5 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT、0.01%NaN3混合，pH 7.5）混合，斩拌破碎为鱼浆，8 000 r/min均质 2 min，低温振荡 30 min后离心，取上清液，沉淀以1 10的料液比复溶，进行二次提取，合并2次提取的上清液即为TGase粗酶液。TGase粗酶液的纯化参考Zhang 等5的方法并稍作修改，将鲢和青鱼 TGase 粗酶液经 80%的（NH4）2SO4盐析，透析脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩后，取 5 mL 盐析液依次过 Q-Sepharose FF、Sephacryl S-200 HR层析柱，收集酶活组分即为纯酶液，4 低温贮藏备用。TGase 的活性测定参考 Hemung 等6和 Worratao等7的方法，测得STG和BTG的比酶活分别为14.34、12.67 U/mg。1.4肌球蛋白的提取参考高霞等8的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白浓度测定采用Lowry法9，以牛血清蛋白为标准品制作标准曲线。1.5不同TGase作用下肌球蛋白样品的制备参考魏莉10的方法并稍作修改，用缓冲液（20 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl）将总钙离子浓度调整到40 mmol/L，BTG和STG添加量为10 U/mg蛋白，肌球蛋白浓度要求见具体的测试指标，以不添加TGase的鲢和青鱼肌球蛋白为空白组。若仅流变学测试样品则不单独进行加热处理，TGase加入肌球蛋白后立即进行升温流变测试，其余指标样品均采取40、60 min加热处理，待样品冷却后立即进行