TSDAA 015-2021 畜禽用噬菌体制剂.pdf

ICSICS 65.020.3065.020.30B B 4343团团 体体 标标 准准T/SDAAT/SDAA 01501520212021畜禽用噬菌体制剂Bacteriophage Preparation for Livestock2021202106062 22 2 发布发布2021202107072 23 3 实施实施山东省畜牧协会发布发布全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1全国团体标准信息平台IIT/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1前言本标准按照 GB/T1.1-2020 给出的规则起草。本标准由山东省畜牧协会提出并归口。本文件起草单位：青岛农业大学、山东益生种畜禽股份有限公司、山东鲁丰集团有限公司、青岛诺安百特生物技术有限公司。本文件主要起草人：张灿、尹燕博、郭龙宗、刘海燕、李忠晓、任慧英、潘强、王守春。全国团体标准信息平台3T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1全国团体标准信息平台4T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1畜禽用噬菌体制剂畜禽用噬菌体制剂1范围本文件规定了畜禽用噬菌体制剂的术语和定义、质量要求和理化指标、试验方法、标签、包装、运输及贮存要求。本文件适用于裂解大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的单株或多株噬菌体为主要原料的畜禽用噬菌体制剂的质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 10648 饲料标签GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定GB/T 191 包装储运图示标志GB/T 9742 化学试剂 pH值测定通则GB/T 36911 运输包装指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1噬菌体 bacteriophage,phage一类能感染细菌、真菌、藻类、放线菌、支原体及螺旋体等微生物的一类病毒的总称，亦称细菌病毒。3.2噬菌斑 plaque噬菌体侵染细菌，导致宿主细胞溶解死亡，在琼脂培养基生长的菌苔上形成的空斑。全国团体标准信息平台5T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 13.3畜禽用噬菌体制剂 bacteriophage preparation含有一株或多株噬菌体为主要成分的制剂。4 质量要求及其理化指标4.1 噬菌体制剂安全要求4.1.1 噬菌体产品应符合国家生物安全法的要求。4.1.2 噬菌体制剂中的噬菌体毒株应安全、有效。4.1.3 噬菌体制剂中的噬菌体毒株应为裂解性噬菌体，遗传背景明确，不携带毒力基因、整合基因。4.1.4 噬菌体制剂产品应有企业标准。4.2 噬菌体制剂理化指标噬菌体制剂的理化指标见附录A.1，附录A.2。5 试验方法5.1 性状将样品放置在洁净的烧杯内，在光线充足、非直射日光、无异味的环境中，用眼观的方法观察其色泽，用鼻嗅的方法检查其气味。5.2 pH 值按照 GB/T 9742 规定执行。5.3 效价按照附录B中的 B.4.1 的规定执行。5.4 杂菌数噬菌体制剂中仍存活的细菌视为杂菌。杂菌数按照 GB 4789.2 规定的微生物菌落总数测定方法执行。全国团体标准信息平台6T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 15.5 裂解效率按照附录B中 B.4.2 的规定执行。6 标签、包装、运输、贮存6.1 标签噬菌体制剂的标签应符合 GB 10648 的规定。标签完整、清晰，标签说明上应注明噬菌体制剂的种类、含量、用法、贮藏条件和方法、保质期、企业名称、生产地址、联系方式等。6.2 包装噬菌体制剂包装应符合 GB/T 191 规定。液体制剂采用塑料瓶或玻璃瓶，规格为：100 mL、200 mL、500 mL/瓶等，或按用户指定要求。粉末制剂的小包装采用铝箔袋，规格为 50 g、100 g、200 g、500 g、1 kg/袋等，或根据用户提出的净含量要求进行包装。粉末制剂的大包装采用内衬塑料袋的编织袋或瓦楞纸箱，每袋（或箱）的规格为 5 kg、10 kg、20 kg、25 kg等，或根据用户提出的净含量要求进行包装。净含量应符合国家质量监督检验检疫总局定量包装商品计量监督管理办法的规定。6.3 运输噬菌体制剂运输应符合 GB/T 36911 运输包装指南。6.4 贮存噬菌体制剂应保存于干燥、避光处，2 8 冷藏保存，在符合运输、贮存条件的情况下，原包装（未开封）产品的保质期为 3 个月以上。全国团体标准信息平台7T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1附录附录A（规范性）（规范性）噬菌体制剂理化指标噬菌体制剂理化指标A.1 液体噬菌体制剂理化指标表 A.1 液体噬菌体制剂理化指标项目指标性状制剂颜色为无色至淡黄色，色泽一致，可有少量絮状沉淀；有培养基自然气味，无发霉、变质现象，无酸败等气味。效价，PFU/mL 1.0108裂解效率，%90pH 值6.0 8.5杂菌数，CFU/mL 100A.2 固体噬菌体制剂理化指标表 A.2 固体噬菌体制剂理化指标项目指标性状制剂颜色为白色至淡黄色的粉末或细小颗粒状，色泽一致，无发霉、结块现象，有培养基自然气味，无酸败等气味。水分15%效价，PFU/mg1.0108裂解效率，%90pH 值6.0 8.5杂菌数，CFU/mg 100全国团体标准信息平台8T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1附录附录B（规范性）（规范性）噬菌斑、噬菌体效价及噬菌体裂解效率测定方法噬菌斑、噬菌体效价及噬菌体裂解效率测定方法B.1 仪器设备B.1.1 恒温培养箱：36 1 B.1.2 离心机：转速12000转B.1.3 超净工作台B.1.4 高压蒸汽灭菌锅B.1.5 恒温震荡培养器：36 1 42 1 B.1.6 电子分析天平：感量0.001 gB.1.7 电热恒温鼓风干燥箱：10 200 B.1.8 冰箱：-40 以下和-20 8 B.1.9 无菌培养皿：90 mmB.1.10 微量移液器：0.5 L 10 L、10 L 200 L、100 L 1000 LB.1.11 漩涡混合仪B.1.12 细菌涂布器B.2 试剂和材料B.2.1LB培养基B.2.2LB固体培养基B.2.3氢氧化钠B.2.4盐酸B.2.5宿主菌（增殖对应的噬菌体）B.3 双层琼脂培养基制备B.3.1 上层固体培养基配置：全国团体标准信息平台9T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1LB固体培养基 2.5%（g/100 mL）琼脂粉 0.75%（g/100 mL）pH值调节到7.2 7.4。B.3.2 下层固体培养基配置：LB固体培养基 2.5%（g/100 mL）琼脂粉 1.5%（g/100 mL）pH值调节到7.2 7.4。B.3.3 液体培养基配置：LB培养基 2.5%（g/100 mL）琼脂粉 1.5%（g/100 mL）pH值调节到7.2 7.4。B.3.4 灭菌配制的培养基于121高压灭菌20 min。B.4 检测步骤B.4.1 噬菌体效价测定取噬菌体制剂样本1 mL(1 mg)，加入9 mL生理盐水中，涡旋混匀，重复上述操作，按照制剂标注的噬菌体含量，将噬菌体制剂样本依次稀释到1102PFU/mL。每次检测设三个平行，取100 L噬菌体稀释液样品，加入至100 L敏感宿主菌的增殖液中，混匀，于宿主菌最佳培养温度条件下孵育5 min，加入5 mL上层半固体培养基，混匀后，倾倒在下层固体培养基上，室温静置至上层半固体培养基凝固。于宿主菌最佳培养条件下倒置培养3 h 8 h，统计噬菌斑个数，按照 B.4.2.3 要求，根据公式(B.1)计算噬菌体效价，三个平行结果取算术平均值。该试验重复三次，报告结果取三次噬菌体效价的算术平均值，结果保留2位有效数字。噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑数 稀释倍数 10.(B.1)B.4.2 噬菌体裂解效率测定B.4.2.1 宿主菌稀释选择用于增殖噬菌体的宿主菌，取1 mL 新鲜制备的宿主菌增殖液，加入9 mL生理盐水中，涡旋混匀，重复上述操作，根据宿主菌增殖液的初始效价直至将宿主菌效价稀释到1105CFU/mL。B.4.2.2 裂解效率测定取1 mL(1 mg)待测定的噬菌体制剂样本，加入1 mL效价为1105CFU/mL的宿主菌稀释液中，室温静置孵育30 min，轻轻混匀后用无菌生理盐水将混合液稀释到10-1、10-2、10-3三全国团体标准信息平台10T/SDAAT/SDAA 0 01515-202-2021 1个梯度，每个梯度分别取100 L加到宿主菌适宜的固体培养基平板上，用无菌涂布器涂布均匀，每个梯度做三个平行，在宿主菌最适培养条件下倒置培养12 h48 h。同时，吸取1 mL效价为1105CFU/mL的宿主菌稀释液，加入1 mL无菌生理盐水作为空白对照处理，重复上述操作步骤。按照 GB 4789.2 中6.3的规定进行平板上菌落计数，按照公式(B.2)计算噬菌体的裂解效率。该试验重复三次，报告结果取平均值。噬菌体裂解效率（%）=1 处理组菌落数对照组菌落数 100%.(B.2)B.4.2.3 计算要求及允许误差范围噬菌斑数量根据 GB 4789.2 中6.3的规定菌落计数原则进行计数。从接种后的三个稀释度中，选择一个合适的稀释度，进行噬菌斑计数或菌落计数，同一稀释度三个重复的菌数或噬菌斑数相近。三次重复试验测定结果的绝对差值20%，以三次测定结果的算术平均值为最终测定结果。_全国团体标准信息平台