细菌的培养及鉴定.ppt

细菌培养及鉴定细菌培养及鉴定 标本采集原则标本采集原则 1 1.及时及时采集微生物标本作病原学检查采集微生物标本作病原学检查 2 2.在抗菌药物在抗菌药物使用前使用前采集标本采集标本 3.3.采样时严格执行采样时严格执行无菌操作无菌操作 4 4.标本标本容器须无菌容器须无菌，但不得有消毒剂但不得有消毒剂 5 5.采样后采样后立即送检立即送检 6 6.送检标本应注明送检标本应注明来源来源和检验和检验目的目的 咳痰方法咳痰方法 病人先病人先漱口，漱口，清洁口腔，清洁口腔，去除表面的菌群去除表面的菌群 病人病人深咳深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用无痰可用35NaCl 5ml雾吸约雾吸约5min导痰导痰 以清晨以清晨第二口第二口痰为佳痰为佳 标本采集后放置时间不超过标本采集后放置时间不超过2小时小时 清洁中段尿液清洁中段尿液 尽量取早晨尽量取早晨第一次第一次尿液尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人女性病人 收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口冲洗尿道口 排出几毫升后，排出几毫升后，不停止不停止尿流，采集尿流，采集中段尿中段尿 男性病人男性病人 翻转包皮，清洗尿道口翻转包皮，清洗尿道口 排出几毫升后，不停止尿流排出几毫升后，不停止尿流,采集采集中段尿中段尿 采集标本后立即送检！采集标本后立即送检！哥伦比亚血平板哥伦比亚血平板营养要求高的细菌营养要求高的细菌 巧克力平板巧克力平板含含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用脑膜炎球菌和淋球菌用 中国蓝中国蓝/麦康凯平板麦康凯平板G-杆菌用杆菌用 SS平板平板沙门氏菌和志贺氏菌用沙门氏菌和志贺氏菌用 M-H平板平板细菌药敏用细菌药敏用 TCBS平板平板弧菌科细菌用弧菌科细菌用 沙包氏平板沙包氏平板真菌培养用真菌培养用 真菌显色平板真菌显色平板真菌培养用真菌培养用 罗氏培养基罗氏培养基分枝杆菌用分枝杆菌用 常用的培养基种类和用途常用的培养基种类和用途 临床标本培养基选择临床标本培养基选择 血血：血培养瓶血培养瓶 中断尿中断尿：血平板、：血平板、mac平板平板 脑脊液脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平：血培养瓶、血平板、巧克力平板板 穿刺液穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平：血培养瓶、血平板、巧克力平板、板、mac平板平板 胆汁胆汁：血平板、巧克力平板、：血平板、巧克力平板、mac平板平板 大便大便:.麦康凯、麦康凯、SSSS、血、血平板平板 细菌接种的基本程序细菌接种的基本程序 灭菌接种环灭菌接种环 沾取标本沾取标本 接种接种 灭菌接种环灭菌接种环 细菌接种法细菌接种法 平板划线接种法：平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本分区划线法：适用于含菌量较多的标本 连续划线法：适用于含菌量较少的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本 分区划线法分区划线法(3区区)第一区划线第一区划线 灭菌接种环灭菌接种环 第二区划线第二区划线 灭菌接种环灭菌接种环 第三区划线第三区划线 灭菌接种环灭菌接种环 连续划线法连续划线法 细菌培养法细菌培养法 一般培养一般培养（需氧培养）：（需氧培养）：培养温度：培养温度：35（采用恒温培养箱）（采用恒温培养箱）培养时间：培养时间：1824h 二氧化碳培养法二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养：烛缸法、二氧化碳培养箱箱 厌氧培养法厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等 细菌在固体培养基中的生长现象细菌在固体培养基中的生长现象 菌落菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏液型）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌菌 落落 菌落与菌苔菌落与菌苔 菌落的三个类型：菌落的三个类型：1 1.光滑型菌落光滑型菌落（SmoothSmooth typetype ColonyColony）：又称：又称S S型型 2 2.粗糙型菌落粗糙型菌落（RoughRough typetype ColonyColony）：又称：又称R R型型 3 3.粘液型菌落粘液型菌落（MucoidMucoid typetype ColonyColony）又称又称M M型型 2023/1/6 16 S型菌落型菌落 R型菌落 M型菌落型菌落 革兰染色革兰染色 原理原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。呈红色。革兰染色步骤革兰染色步骤 涂片包括涂片涂片包括涂片、干燥干燥、固定三步固定三步。涂片涂片 干燥干燥 固定固定 固定的目的：固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。结晶紫结晶紫 1 1 碘液碘液 1 1 95%95%乙醇乙醇 3030”复红复红1 1 冲洗冲洗 滤纸干燥滤纸干燥 油镜观察油镜观察 冲洗冲洗 冲洗冲洗 冲洗冲洗 革兰染色程序革兰染色程序 初染初染 媒染媒染 脱色脱色 复染复染 紫色（紫色（G）革兰氏染色步骤示意图革兰氏染色步骤示意图 革兰染色革兰染色 甲甲菌菌 乙乙 菌菌 初染初染 结晶紫结晶紫 媒染媒染 碘液碘液 脱色脱色 乙醇乙醇 复染复染 稀释复红稀释复红 紫色（紫色（G）红色（红色（G-）革兰染色步骤示意图革兰染色步骤示意图【结果结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌阳性菌紫色紫色（G+b)G+b)阴性菌阴性菌红色（红色（G G-b)b)G+球菌 显微镜下的杆菌 G-杆菌 Figure 2-Gram stain of Gram-E.coli cells 痰标本涂片染色低倍镜下分类痰标本涂片染色低倍镜下分类 分级分级 白细胞白细胞（个）（个）上皮细胞上皮细胞（个）（个）A 25 25 25 C 25 A、B两种情况的痰适合做培养，两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标不合格，应重新留标本本 革兰染色注意事项革兰染色注意事项 标本标本涂片涂片不宜不宜太厚太厚 固定固定不宜不宜过热过热 脱色脱色不宜不宜过度过度 选用培养选用培养18-24小时小时菌龄的细菌为宜菌龄的细菌为宜 抗酸染色抗酸染色 原理原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中其中主要成分为分枝菌酸主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性此物具有抗酸性,染染色时与石炭酸复红结合牢固色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性能抵抗酸性乙醇的脱色作用乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红因此抗酸菌能保持复红的颜色的颜色,达到染色目的。达到染色目的。抗酸染色步骤抗酸染色步骤 1、涂片包括涂片涂片包括涂片、干燥干燥、固定三步固定三步。涂片涂片 干燥干燥 固定固定 抗酸染色步骤抗酸染色步骤 2、染色包括初染、脱色、复染三步。、染色包括初染、脱色、复染三步。石炭酸复红维持石炭酸复红维持 3-5 5 3%盐酸酒精盐酸酒精30 1 美蓝复染美蓝复染1 冲洗冲洗 干燥干燥 油镜观察油镜观察 冲洗冲洗 冲洗冲洗 初染初染 脱色脱色 复染复染 抗酸染色结果抗酸染色结果 抗酸菌呈红色抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。抗酸杆菌报告抗酸杆菌报告 300个视野仅见到个视野仅见到18条抗酸杆菌填写条条抗酸杆菌填写条数数 1+：镜检查见：镜检查见3-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/100高倍镜高倍镜视野视野 2+：镜检查见：镜检查见19条抗酸杆菌条抗酸杆菌/10高倍镜高倍镜视野视野 3+：镜检查见：镜检查见1-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视高倍镜视野野 4+:镜检查见镜检查见9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视野高倍镜视野 抗酸染色注意事项抗酸染色注意事项 染色染色充分充分 脱色时间脱色时间宁长勿短宁长勿短 在涂抹痰标本时在涂抹痰标本时严禁严禁对载玻片进行对载玻片进行加热加热 临床标本培养基选择临床标本培养基选择 生殖道标本根据临床医生所写的检验项生殖道标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作目接种相应的平板及操作：淋球菌培养接种淋球菌平板淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培养的操作规程操作；作普通培养则接种血平养的操作规程操作；作普通培养则接种血平板和巧克力平板板和巧克力平板 观察细菌在平板上的生长现象观察细菌在平板上的生长现象 血平板血平板：大小、形状、边缘、颜色、表：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 mac平板平板：大小、形状、颜色、透明度、：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度湿润度、黏度 巧克力平板巧克力平板：大小、形状、颜色、透明：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度度、湿润度、黏度 2023/1/6 37 革兰阴性菌革兰阴性菌 葡萄球菌葡萄球菌 细菌的初步分类细菌的初步分类 细菌的分离与纯化细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该重新转种分纯。该重新转种分纯。染色与镜检染色与镜检：首先通过革兰氏染色确定基本首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（的分类：（1）G+球菌（球菌（2）G-球菌（球菌（3）G-杆杆菌（菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。能是真菌。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 最重要最重要的致病葡萄球菌的致病葡萄球菌 血平板上菌落有明显血平板上菌落有明显溶血环溶血环，颜色呈金，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色黄色、灰白色或柠檬色 分解分解葡萄糖葡萄糖、麦芽糖麦芽糖、蔗糖蔗糖和和甘露醇甘露醇 血浆凝固酶和血浆凝固酶和DNA酶酶阳性阳性 2023/1/6 41 葡萄球菌葡萄球菌 念珠菌显色培养基念珠菌显色培养基 绿色绿色白色念珠菌白色念珠菌 蓝色蓝色热带念珠菌热带念珠菌 白色白色其他，细菌被其他，细菌被抑制抑制 紫色紫色光滑光滑 粉色粉色克柔假丝酵母克柔假丝酵母菌菌 嗜血杆菌的鉴定途径嗜血杆菌