农业部869号公告-2-2007 转基因生物及其产品食用安全检测 模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法.pdf

ICS67.050X04中华人民共和国国家标准农业部869号公告一2一2007转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法Food safety detection of genetically modified organisms and derived productsMethod of target protein digestive stability in simulative gastricand intestinal fluid2007-06-11发布2007-08-01实施中华人民共和国农业部发布农业部869号公告一2一2007转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法1范围本标准规定了外源蛋白质在模拟胃液和模拟肠液消化稳定性的检测方法。本标准适用于转基因生物及其产品中外源基因表达蛋白质或者用微生物表达的与植物中的外源蛋白具有实质等同性的蛋白质产物在模拟胃液和模拟肠液消化条件下稳定性的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1外源蛋白质exogenous protein从转基因生物中提取的通过基因工程手段转人生物中的外源基因所表达的蛋白质产物，或者将转基因植物中的外源基因转人微生物中所表达的与植物中的外源蛋白质具有实质等同性的蛋白质产物。2.2模拟胃消化液stimulated gastric fluid(SGF)模拟人体胃液中的pH、盐离子浓度及胃蛋白酶浓度设置的消化液。2.3模拟肠消化液stimulated intestinal fluid(SF)模拟人体肠液中的pH、盐离子浓度及胰酶浓度设置的消化液。2.4稳定对照蛋白stable control protein为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃/肠液中60n内不能被完全消化的蛋白质。2.5不稳定对照蛋白labile control protein为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃/肠液中2in内完全被消化的蛋白质。3原理根据人体胃/肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃/肠消化体系，将转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在该体系中进行消化，对不同消化时间的样品进行蛋白电泳和蛋白印迹，确定该蛋白在模拟胃液和模拟肠液中被消化的时间，推断转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在模拟人体胃/肠消化过程中的稳定性。4试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯化学试剂和重蒸馏水。4.1模拟胃消化液(SGF):本标准中采用的胃蛋白酶(pepsin)活力不能低于2000U/g根据公式(1)计算100L模拟胃液中的胃蛋白酶的添加量：A=5106(1)19xB农业部869号公告一2一2007式中：A一胃蛋白酶添加量，单位为毫克(mg);B一胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克(U/g)。称取0.2g氯化钠(NaCl)和Amg胃蛋白酶，加人70mL重蒸馏水，加人730L盐酸，再用盐酸调pH至1.2，加水定容至100mL。现用现配。4.20.2mol/L氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠(NaOH),溶于重蒸馏水中，定容至100mL。4.3模拟肠消化液(SIF):本标准中采用的胰酶(pancreatin)应满足405min内，能将其质量的25倍的淀粉转化为水溶性的碳水化合物；4060min内(pH7.5),消化掉其质量的25倍的酪蛋白；37(pH9.0),每毫克胰酶每分钟能够从橄榄油中至少水解生成2ol脂肪酸。称取0.7g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于25mL重蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19mL0.2mol/L氢氧化钠溶液和40mL重蒸馏水，加入1.0g胰酶，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5，加重蒸馏水定容至100mL。现用现配。4.4样品蛋白溶液：4.4.1模拟胃液消化样品蛋白溶液(5g/L):称取5g样品蛋白，定容于1mL重蒸馏水中，混匀。4.4.2模拟肠液消化样品蛋白溶液(2g/L):称取2mg样品蛋白，定容于1L重蒸馏水中，混匀。4.5不稳定对照蛋白溶液：4.5.1模拟胃液消化不稳定对照蛋白溶液：选用酪蛋白(a-casein)或牛血清白蛋白(bovine serum albu-min,BSA)作为模拟胃液消化不稳定对照。配制方法同4.4.1。4.5.2模拟肠液消化不稳定对照蛋白溶液：选用酪蛋白(a-casein)或牛B-乳球蛋白B(bovine B-lactoglobulin,BLG)作为模拟肠液消化不稳定对照。配制方法同4.4.2。4.6稳定对照蛋白溶液：4.6.1模拟胃液消化稳定对照蛋白溶液：选用牛B乳球蛋白B(BLG)或大豆胰蛋白酶抑制剂(soybeantrypsin inhibitor,STI)作为模拟胃液消化稳定对照。配制方法同4.4.1。4.6.2模拟肠液消化稳定对照样品溶液：选用牛血清白蛋白(BSA)或大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)作为模拟肠液消化稳定对照。配制方法同4.4.24.70.2mol/L碳酸氢钠(NaHCO3)溶液：称取1.7g碳酸氢钠(NaHCO:),溶于重蒸馏水中，定容至100mL.4.83mol/L盐酸溶液：量取26mL盐酸，加重蒸馏水定容至100mL4.9分离胶缓冲液(1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl),pH8.8):称取9.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加45mL重蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用3mol/L盐酸溶液调pH至8.8，再加水定容至50mL,4下贮存备用。4.10浓缩胶缓冲液(1.0mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tis-HC),pH6.8):称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加45mL重蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用3ol/L盐酸溶液调pH至6.8，再加水定容至50mL,4下贮存备用。4.11300g/L丙烯酰胺单体储液(Acr/Bis):称取29.1g丙烯酰胺(Acr),0.9gN,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis),溶于80mL重蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加水定容至100mL,滤纸过滤，4下避光保存备用。2农业部869号公告一2一20074.12100g/L十二烷基磺酸钠(SDS):称取5.0g十二烷基磺酸钠(SDS)溶于45L重蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加水定容至50mL。4.13100g/L过硫酸铵(AP):称取0.1g过硫酸铵(AP),溶于1mL重蒸馏水中。4中保存，并在1周内使用。4.14蛋白样品上样缓冲液(5Laemmli buffer,pH6.8):称取10.0g十二烷基磺酸钠(SDS),加入40mL甘油，33mL浓缩胶缓冲液(pH6.8),5mL3巯基乙醇，加水定容至100mL,再加入0.05g溴酚蓝，混匀。4.1550g/L三氯乙酸(TCA):称取5.0g三氯乙酸(TCA),溶于100mL重蒸馏水中。现用现配。4.16十二烷基磺酸钠(SDS)洗脱液：在455mL甲醇中加入90mL乙酸，用水定容至1000mL。4.17考马斯亮蓝染色液：量取150mL甲醇，100mL冰乙酸，加水定容至1000mL,再加入1.0g考马斯亮蓝，混匀，滤纸过滤后使用。4.18脱色液：在250mL甲醇中加入75mL乙酸，加水定容至1000mL。4.19电泳缓冲液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tis),14.4g甘氨酸，1.0g十二烷基磺酸钠(SDS),溶于800mL重蒸馏水中，用3mol/L盐酸溶液调pH至8.3，加水定容至1000mL。4.20转移缓冲液：称取3.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),14.4g甘氨酸，甲醇200mL,加水定容至1 000 mL4.21TBS缓冲液：称取1.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),8.8g氯化钠(NaC),加800mL重蒸馏水，用3mol/L盐酸溶液调pH至7.5，加水定容至1000ml。4.22TBST1缓冲液：在500 mL TBS缓冲液中，加入250L吐温20(Tween20),用磁力搅拌器混匀。4.23TBST2缓冲液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tis),4.4g氯化钠(NaCI),加重蒸馏水400mL,再加入500uL吐温20(Tween20),搅拌混匀，加水定容至500mL。4.24碱性磷酸酶显色缓冲液：称取1.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),0.6g氯化钠(NaCI),1.0g氯化镁(MgC26H2O),加80mL重蒸馏水溶解，定容至100mL。4.25蛋白印迹显色液：加66L四氨唑兰(NBT)溶液于10L碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀后，加入33L5溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐(BCIP)溶液，混匀。现用现配。4.26封闭液：在50 LTBST1缓冲液中加入1.5g牛血清白蛋白(BSA),混匀。4.27一抗工作液：在50mL封闭液中，加入50L目标蛋白抗血清。4.28二抗工作液：在20 mLTBST2缓冲液中，加人0.2g牛血清白蛋白(BSA),混匀溶解后，再加入20L碱性磷酸酶标记二抗。4.2915%分离胶：按表1依次吸取各种组分于50mL锥形瓶中，其间摇动混匀。表115%分离胶的配制各种溶液组分名称各组分的取样量(mL)重蒸馏水2.3300g/L丙烯酰胶储液(Acr/Bis)5.0分离胶缓冲液2.5100g/L十二烷基磺酸纳(SDS)0.1100g/L过疏酸铵(AP)0.1N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)0.004总体积104.305%浓缩胶：3