TYNBX 024-2020 饲料添加剂 凝结芽孢杆菌的测定.pdf

ICS团体标准T/YNBX 0242020饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定2020-07-20 发布2020-07-25 实施云南省标准化协会发 布全国团体标准信息平台T/YNBX 0242020I前言本标准按照 GB/T 1.1和团体标准管理规定给出的规则制定。本标准由云南省标准化协会提出并归口。本标准主要起草单位：昆明三正生物科技（集团）有限公司、云南师范大学生命科学院、临沂市布恩饲料有限公司、中国农业大学动物科技学院、福建新正阳饲料科技有限公司、四川农业大学动物营养研究所、青岛贝宝海洋科技有限公司、云南农业大学动物科学技术学院、山东梵蓝科技有限公司、昆明理工大学生命科学院、济南百鸣生物制药有限公司、西南大学荣昌校区水产学院、南京嘉泰生物科技有限公司、华南农业大学食品学院、昆明爱科特生物科技有限公司、云南省饲料工业协会、佛山市三水君威饲料厂有限公司、成都三旺农牧股份有限公司、广东恒兴集团有限公司、深圳澳华集团股份有限公司。本标准主要起草人：李亚平、冯莲英、车丽涛、王春曦、黄遵锡、于娟、王忠、林登峰、余冰、王磊、程志斌、郭海涛、林连兵、韩克学、郑宗林、刘凌云、方祥、罗荣华、陶冶、陈贵云、任花池、杨曦、邓登。本标准使用单位：主要起草单位及云南省标准化协会授权使用单位。本标准为首次发布。全国团体标准信息平台T/YNBX 02420201饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定1范围本标准规定了饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定方法。本标准适用于饲料添加剂凝结芽孢杆菌的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1凝结芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，菌体形态呈杆状，两端钝圆，革兰氏阳性菌，能分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌，有芽孢，端生。4实验方法4.1菌体形态检验4.1.1菌种的制备自平板上挑取单菌落，划线转接培养于MRS改良培养基平板上，40 1，培养48 h2 h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行形态检验。4.1.2形态检验将挑选纯化的菌落做革兰氏染色，镜检。凝结芽孢杆菌细胞应为杆状，两端钝圆，有芽孢，端生。4.2活菌计数4.2.1检验试剂与仪器除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。4.2.1.1稀释液全国团体标准信息平台T/YNBX 02420202稀释液是用于稀释试样的溶液，本检测方法的稀释液为0.9%氯化钠和1 的吐温80水溶液。配制完成后，分装100 mL至装有50 g玻璃珠的250 mL三角瓶中,分装9 mL稀释液至规格为18 mm180mm（或15 mm150 mm）的试管中，121 灭菌30 min。4.2.1.2培养基（每 100 mL 培养基含有）蛋白胨1 g、酵母膏0.5 g、葡萄糖0.5 g（无需分开灭菌）、牛肉膏0.5 g、无水氯化钙15 mg、一水合硫酸锰0.01 g、氯化钠0.25 g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05 g、番茄粉0.05 g、琼脂粉2.5 g。调节pH至5.2，121 灭菌 30 min。4.2.1.3实验仪器除微生物实验室常规器材及设备外，应有以下设备及材料：a)恒温摇床：171；b)恒温培养箱：401；c)无菌移液枪：200L、1000L；d)无菌枪头：200L、1000L；e)pH 计：精确到0.1 个单位；f)玻璃或塑料涂布棒；g)涡旋仪。4.2.2实验步骤4.2.2.1精确称量 1.000 g 待测试样，注意称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使用，每个试样 23 个重复。4.2.2.2将试样在无菌操作条件下，加入装有 100 mL 稀释液的三角瓶中，摇床 220 r/min 振荡 30 min，做成 10-2菌悬液。4.2.2.3在无菌操作条件下将 10-2菌悬液用移液器取 1 mL 到装有 9 mL 稀释液的试管中，重复操作逐级稀释至所需稀释度。注意移液器吸取试样前要润洗枪头 3 次以上，加入试样后无需冲洗枪头，每递增稀释一次，更换一个枪头，每个稀释梯度加入试样后要在涡旋仪上混匀 30 s 再吸入到下一支试管内。4.2.2.4估算试样中的菌含量，选取 23 个适当稀释度，吸取一定量菌悬液（计算长出菌落在 30300 个），用培养基进行倾注培养，充分混匀后静置冷却凝固，每个稀释度 3 个重复。4.2.2.5将凝固后的平板放入 40 培养箱中倒置培养 48 h 左右，选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数。4.2.3活菌含量计算4.2.3.1活菌含量按式（1）计算）（1NLXA式中：A试样中活菌数，CFU/g；X某一稀释度下菌落数量的平均值；L转换系数（平板中加入的菌液量转换为1 mL）；N稀释倍数。最终结果按照GB/T 8170数值修约规则修约至整数。4.2.3.2注意事项全国团体标准信息平台T/YNBX 024202034.2.3.2.1810910109CFU/g 凝结芽孢杆菌建议选择 107（添加 100L）和 108（添加 1000L）两个稀释度进行倾注。4.2.3.2.2倾注后应匀速、顺时针和逆时针交替摇动平板多次（不低于 20 次），勿将培养基摇出平板。4.3杂菌率检测4.3.1稀释液同4.2.1.1。4.3.2培养基（每 100mL 培养基含有）同4.2.1.2。4.3.3实验仪器同4.2.1.3。4.3.4实验步骤4.3.4.1精确称量 1.000 g 待测试样，注意称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使用，每个试样 23 个重复。4.3.4.2将试样在无菌操作条件下，加入装有 100 mL 稀释液的三角瓶中，摇床 220 r/min 振荡 30 min，做成 10-2菌悬液。4.3.4.3在无菌操作条件下将 10-2菌悬液用移液器取 1 mL 到装有 9 mL 稀释液的试管中，重复操作逐级稀释至所需稀释度。注意移液器吸取试样前要润洗枪头 3 次以上，加入试样后不冲洗枪头，每递增稀释一次，更换一个枪头，每个稀释梯度加入试样后要在涡旋仪上混匀 30 s 再吸入到下一支试管内。4.3.4.4估算试样中的菌含量，选取 23 个适当稀释度，吸取一定量菌悬液（计算长出菌落在 30300 个）至平板中，用涂布器涂开，需要涂干，每个梯度涂布 3 个平板，涂布器不能重复使用。4.3.4.5将平板放入 40 培养箱中倒置培养 48 h 左右，对不同形态的菌落进行计数。4.3.5菌含量计算菌含量按式（2）计算。）（2NLXA式中：A试样中活菌数，CFU/g；X某一稀释度下菌落数量的平均值；L转换系数（平板中加入的菌液量转换为1mL）；N稀释倍数。最终结果按照GB/T 8170数值修约规则修约至整数。4.3.6杂菌率计算4.3.6.1杂菌率按式（3）计算）（3%10012AAA式中：A杂菌率，%；全国团体标准信息平台T/YNBX 02420204A2计数得到的杂菌总菌数，CFU/g；A1计数得到的总菌数，CFU/g。4.3.6.2注意事项4.3.6.2.1用于涂布的检测培养基需提前倒好，用报纸包好后放入培养箱（37）培养 12 h，使用时筛除杂菌污染的平板。4.3.6.2.2针对肉眼可分辨的非凝结芽孢杆菌菌落，可直接计数并计算杂菌率。如果不确定长出菌落是否为杂菌，则可以挑取该菌落进行纯化之后进行 16S rRNA 基因鉴定。4.3.6.2.3810910109CFU/g 凝结芽孢杆菌建议选择 107（添加 100 L）和 108（添加 300 L500L）两个稀释度进行涂布。4.3.6.2.4涂布时，需旋转平板角度 3 次，充分均匀涂布。4.4耐热性检测4.4.1检验试剂与仪器同 4.2.1，检验仪器增加水浴锅 90 1。4.4.2实验步骤4.4.2.1精确称量 1.000 g 待测试样，注意称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使用，每个试样 23 个重复。4.4.2.2将试样在无菌操作条件下，加入装有 100 mL 稀释液的三角瓶中，摇床 220 r/min 振荡 30 min，做成 10-2菌悬液。4.4.2.3在无菌操作条件下将 10-2菌悬液用移液器取 1 mL 到装有 9 mL 稀释液的试管中混匀，制成 10-3菌悬液，每个试样两支试管。取其中一支 10-3菌悬液作为实验组放入水浴锅中进行水浴：90 预处理 2min，持续水浴 15 min 之后，取出迅速冷却。另一支 10-3菌悬液作为空白组不做热处理。注意移液器吸取试样前要润洗枪头 3 次以上，加入试样后不冲洗枪头，每递增稀释一次，更换一个枪头，每个稀释梯度加入试样后要在涡旋仪上混匀 30 s 再吸入到下一支试管内。4.4.2.4在无菌操作下将 10-3菌悬液逐级稀释至所需稀释度。4.4.2.5估算试样中的菌含量，选取 23 个适当稀释度，吸取一定量菌悬液（计算长出菌落在 30300个），用检测培养基进行倾注培养，充分混匀后静置冷却凝固，每个稀释度 3 个重复。4.4.2.6将凝固后的平板放入 40 培养箱中倒置培养 48 h 左右，选取菌落数在 30300 之间的平板进行计数。4.4.3菌含量的计算菌含量按式（4）计算）（4NLXA式中：A试样中活菌数，CFU/g；X某一稀释度下菌落数量的平均值；L转换系数（平板中加入的菌液量转换为1mL）；N稀释倍数。最终结果按照GB/T 8170数值修约规则修约至整数。4.4.4耐热性（率）计算全国团体标准信息平台T/YNBX 02420205耐热性（率）按式（5）计算。）（5100%chAAn式中：n热处理后活菌耐热（性）率，%；Ah计数得到的菌含量，CFU/g；Ac未热处理得到的菌含量，CFU/g。_全国团体标准信息平台