TYNYY 0001-2021 苹果矮化自根砧木组培快繁技术规程.pdf

ICS 65.020.20 CCS YNYY B31 云南省团体标准 T/YNYY 00012021 苹果矮化自根砧木组培快繁技术规程苹果矮化自根砧木组培快繁技术规程 Technical regulations for tissue culture and rapid propagation of Apple Dwarf Rootstock 2021-10-09 发布 2021-10-10 实施 云南省园艺学会 发 布 全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省农业科学院园艺作物研究所提出。本文件由云南省园艺学会归口。本文件起草单位：云南省农业科学院园艺作物研究所、云南大学、云南农业职业技术学院、昭通市苹果产业发展中心。本文件主要起草人：黄文静、杨光柱、刘丹丹、马钧、赵俊伟、丁仁展、苏俊、鲁兴凯、马勉娣。全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 II 全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 III 苹果矮化自根砧木组培快繁技术规程 1 范围 本文件规定了苹果（Malus spp.）砧木组织培养繁育生产过程中的设备、试剂及规划、培养基制备、组培室消毒灭菌、砧木组培苗生产、组培苗质量及包装、标签和运输等技术内容。本文件适用于苹果砧木(JM系列、CG系列、M系列、青砧系列)组织培养繁育苗木。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1085 苹果苗木繁育技术规程 NY/T 2719 苹果苗木脱毒技术规范 NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 NY/T 2036、NY/T 2719、NY/T 1085等界定的术语和定义适用于本文件。4 设备、试剂及规划 4.1 设备、试剂按 NY/T 2306 的规定执行。4.2 组培苗繁育实验室或组培生产工厂规划应包括培养基制备灭菌室、清洗室、接种室、培养室、储存室（仓库）、温室或大棚等。5 培养基制备 5.1 配方 5.1.1 基本培养基 基本培养基采用MS培养基、LS培养基、QL培养基（顺序和附录相符），具体成分、配制母液浓度分别见附录A和附录B、附录C。5.1.2 外植体初代培养基 5.1.2.1 矮化自根砧 JM 系列 LS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）3.0 mg/L4.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.1 mg/L0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH5.8 pH6.0。5.1.2.2 矮化自根砧 CG 系列 QL+6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5 mg/L1.0 mg/L+吲哚乙酸（IAA）0.1 mg/L0.2 mg/L+萘乙酸（NAA）0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 IV 5.1.2.3 矮化中间砧 M 系列 MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L2.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.025 mg/L0.05mg/L+吲哚丁酸（IBA）0.2 mg/L0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉79 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.2.4 半矮化自根砧青砧系列 MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）4.0 mg/L5.0 mg/L+萘乙酸（NAA）0.2 mg/L0.3mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.3 增殖培养基 5.1.3.1 矮化自根砧 JM 系列 LS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）2.0 mg/L2.5 mg/L+萘乙酸（NAA）0.1 mg/L0.2mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.3.2 矮化自根砧 CG 系列 QL+6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L1.5 mg/L+玉米素（ZT）0.1 mg/L0.2 mg/L+萘乙酸（NAA）0.1 mg/L0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.3.3 矮化中间砧 M 系列 MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L1.5 mg/L+萘乙酸（NAA）0.05 mg/L0.1mg/L+吲哚丁酸（IBA）0.2 mg/L0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.3.4 半矮化自根砧青砧系列 MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L2.0 mg/L+吲哚乙酸（IAA）0.1 mg/L0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.4 生根培养基 5.1.4.1 矮化自根砧 JM 系列 1/2LS+萘乙酸（NAA）0.3 mg/L0.5 mg/L+吲哚乙酸（IAA）0.5 mg/L1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.4.2 矮化自根砧 CG 系列 1/2QL+萘乙酸（NAA）0.3 mg/L0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.1.4.3 半矮化自根砧青砧系列、M 系列 1/2MS+吲哚乙酸（IAA）0.5 mg/L1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂粉7 g/L9 g/L，pH 5.8 pH 6.0。5.2 培养基母液 培养基母液配制应符合以下要求：a)选用化学纯以上纯度的化学试剂，使用去离子水配制；b)根据附录 A、附录 B 和附录 C 的基本培养基配方成分分组和浓度扩大倍数，分别配制大量元素（20 倍）母液、钙元素（20 倍）母液、微量元素（200 倍)母液、铁元素（100 倍）母液和有机物（100 倍）母液；全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 V c)植物生长调节物质配制成单一成分母液，浓度宜为 1 mg/ml；d)有机物母液、铁元素母液和植物生长调节物质母液应储存在棕色试剂瓶中，试剂瓶分别贴上标签，标注母液名称、配制倍数、配制日期和有效期、配制人，置于冰箱冷藏保存。5.3 培养基配制 按以下步骤进行培养基配制：a)根据培养基配方与培养基配制数量，计算各种母液的用量及配方中其它成分的用量，并记录；b)按照计算结果称量琼脂粉与蔗糖（或白砂糖），加入去离子水中，去离子水的量以培养基配制体积的 1/22/3 为宜，不断搅拌；c)加入相应母液，加去离子水定容，充分搅拌均匀；d)用 1.0 mol/L 盐酸或 1.0mol/L 氢氧化钠调节 pH 值至 5.86.0。e)将培养基分装到培养瓶中，用封口膜、封口盖或棉塞加牛皮纸封口；f)将培养基放入高压蒸汽灭菌器内灭菌。灭菌温度 121为宜，灭菌时间 15 min20 min；g)灭菌后的培养基在干净、阴凉的室内常温平放保存，保存时间不宜超过 2 周。6 组培苗生产 6.1 组培室消毒灭菌 见附件D 6.2 无菌接种前的准备 超净工作台提前 20 min开机及紫外灯，接种前关闭紫外灯，用75%的酒精擦拭工作台台面及内壁。接种工具用酒精擦拭或浸泡，再用电热接种工具灭菌器（280320）灼烧灭菌后，置物架上冷却至常温使用，消毒瓶、灭菌水备用。6.3 外植体初代培养 6.3.1 外植体的采集及处理 在母本采穗圃中选择性状稳定、生长健壮、无病虫危害和机械损伤的植株。在春季采集由叶芽萌发长出几片小幼叶的幼嫩新梢、未木质化或半木质化新梢，去除新梢上展开的叶片，未展开的小幼叶可不去除。亦可选用一年生枝，将基部浸于水中室内催芽，待叶芽萌动长出幼嫩新梢后及时采集。外植体表面用洗洁精清洗干净，新梢剪成 5 cm 长段，置于瓶中。6.3.2 外植体消毒 在无菌瓶中使用 75%酒精消毒，时间 0.5 min1 min，无菌水清洗 3 遍，用 0.1%氯化汞溶液，消毒时间 6 min15 min，无菌水清洗 4 遍6 遍。消毒时间可根据材料的幼嫩程度、洁净程度适当调整。消毒期间多次摇动消毒瓶，使外植体与消毒剂充分接触。使用过的氯化汞废液禁止随意倾倒，应妥善收集保存，交由当地环保部门处理。6.3.3 外植体的切块及接种 长度 1 cm 以下的幼嫩新梢去掉外围叶片，基部切去接触消毒液的部分，接入初代培养基。较长的新梢切带腋芽的单节茎段，节位密集时，亦可切双节或多节茎段接种。每瓶接 1 个4 个外植体，接种分布均匀，插入培养基 0.5-1cm，保持腋芽露出培养基表面。封好培养瓶口，注明品种编号、接种人员、接种日期、培养基编号等信息，放至培养箱或培养室培养。外植体出现褐化时要频繁多次转接。6.4 增殖培养 增殖培养符合以下要求：全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 VI a)将初代培养材料，去除基部愈伤组织、老化组织、褐化组织，切分成 0.5 cm1.5 cm 大小的丛梢或茎段，接入继代培养基，置于培养箱或培养室培养；b)材料摆布匀称，间距 1.0 cm2.0 cm；c)培养 4 周6 周左右进行一次增殖转接，转接后继续培养；d)增殖阶段，苗发生“玻璃化”，可在增殖培养基中添加 1.0 g/L2.5 g/L 聚乙烯醇（PVA）。e)每代增殖系数达 5-6，增殖代数不应超过 12 代。6.5 生根培养 增殖培养8 代12 代，切取高度大于2 cm的粗壮嫩梢，转入生根培养基，每瓶接种4 苗5 苗，进行生根培养。6.6 培养条件 外植体初代培养、增殖培养、生根培养各阶段的接种材料均放至培养箱或培养室进行，温度（241），光照强度1 500 Lx2 000 Lx，10 h12 h光照。6.7 瓶苗移栽 6.7.1 移栽条件 宜在温室（或大棚）进行炼苗，温度宜22-26，光照强度18 000Lx30 000 Lx。6.7.2 移栽容器及基质 移栽容器可选用塑料或无纺布营养钵。基质可用蛭石、草炭、沙壤土1:1:1混合，装入移栽容器的2/3处，浇透水，并喷洒。6.7.3 组培苗质量 组培苗炼苗应选择无细菌、真菌污染，苗高3 cm以上，不定根3 条以上，有侧根生长，幼茎粗壮，茎基部没有或有少量愈伤组织，长有3 片4 片叶片，叶片发育良好，无黄叶，无枯尖的瓶苗。生根培养3周5周后，不定根长至约1.0 cm时，将组培苗由培养室移至温室，闭瓶炼苗20 d左右，闭瓶锻炼后除去封口材料，开瓶锻炼5 d7 d，期间保持水分，注意遮阴。炼好的组培苗，洗去根部培养基，即可移栽。6.7.4 移栽 将清洗干净的组培苗，直立置于移栽容器的基质上，根系尽量舒展，用0.1%多菌灵药液搅拌消毒过的蛭石覆盖并固定根系。栽后放置于温室或大棚中，喷洒0.1%多菌灵液防病，扣小拱棚保持水分保，温度22-26，湿度65%-75%，注意前期遮阴。6.7.5 栽后管理 移栽7 d10 d后，逐渐揭膜通风，降低湿度到40%-50%，直至完全除去薄膜。每1周2周喷1次0.1%多菌灵。后期，根据小苗生长状况，不同苹果矮化自根砧采用MS、LS、QL营养液作为补充。6.7.6 大田移栽 6.7.6.1 苗圃地选择按 NY/T 1085 的规定执行。6.7.6.2 移栽前加强通风炼苗，控制浇水，高温季节应适当遮阴。6.7.6.3 移栽 60 d70 d 后，成活苗地上部分高度大于 10 cm，可带基质移栽至大田苗圃地中。6.8 脱病毒苗培育 全国团体标准信息平台T/YNYY 00012021 VII 利用茎尖培养脱除病毒培育无病毒原种和无病毒苗时，应剥取0.1 mm0.2 mm的茎尖分生组织（带1个或2个叶原基）作为外植体接种。脱毒方法及病毒检测方法