TZNX 018-2021 农药室内生物测定试验准则 控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验方法.pdf

ICS 65.020.01CCS B 17团体标准T/ZNX 0182021农药室内生物测定试验准则控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验方法Pesticide guidelines for laboratory bioactivity testsAlgaecide activity on Microcystis aeruginosa2021-11-30 发布浙江省农药工业协会发布2021-12-06 实施全国团体标准信息平台T/ZNX 0182021I目次前言.II1 范围.32 规范性引用文件.33 术语和定义.34 试验概述.35 试验方法.35.1 材料和条件.35.1.1 供试生物.35.1.2 供试物.35.1.3 主要仪器设备.35.1.4 培养基.45.1.5 试验条件.45.2 试验操作.45.2.1 试验用藻的预培养.45.2.2 预试验.45.2.3 正式试验.45.3 数据处理.45.3.1 生物量增长的抑制百分率.45.3.2 生长率的抑制百分率.45.3.3 半效应浓度.55.4 质量控制.56 试验报告.57 结果.5附录A 培养基配方.6全国团体标准信息平台T/ZNX 0182021II前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农药工业协会提出并归口管理。本文件起草单位：宁波三江益农化学有限公司。本文件主要起草人：黄小威、陈俊鹏、张有根、陈润丽、杨婷婷、徐宗余、桑松。全国团体标准信息平台T/ZNX 01820213农药室内生物测定试验准则控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验方法1范围本文件规定了控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验的试验方法、试验操作、数据处理、质量控制、试验报告等的基本要求。本文件适用于控藻剂对铜绿微囊藻活性测定的室内试验和评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 31270.14-2014化学农药环境安全评价试验准则 第14部分：藻类生长抑制试验3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试验概述本试验用供试物配制一系列不同浓度的试验药液，然后将试验药液与藻液混合后，连续72h观察实验用藻的生长抑制情况，并求出半效应浓度EC50（72h）值以及95%置信限。5试验方法5.1材料和条件5.1.1供试生物铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）。5.1.2供试物农药制剂、原药或纯品。对难溶于水的农药，可用少量对藻毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂助剂，用量不超过0.1 mL（g）/L。5.1.3主要仪器设备血球计数板。分光光度计(光谱：3251000nm)。显微镜。光照培养箱。高压蒸汽灭菌锅。玻璃器皿等。全国团体标准信息平台T/ZNX 01820214条码扫描器（识别精度：一维码5mil，二维码10mil）；各仪器设备，具备条码编号。5.1.4培养基采用BG-11培养基培养铜绿微囊藻，培养基配方参见附录A。5.1.5试验条件试验环境温度21 24，单次试验试验温度控制在2；连续均匀光照，光照强度差异应保持在15%范围内，光强4440 lx8880 lx。5.2试验操作5.2.1试验用藻的预培养按无菌操作法将试验用藻接种到装有培养基的锥形瓶内，在5.1.5的条件下培养。每隔96h接种一次，反复接种2次3次，使藻基本达到同步生长阶段，以此作为试验用藻。每次接种时在显微镜下观察，检查藻种生长情况。5.2.2预试验按正式试验的条件，以较大的间距设置若干组浓度，求出供试物使实验用藻生长受抑制的最低浓度和不受抑制的最高浓度，在此范围内设置正式试验的浓度。5.2.3正式试验在预试验确定的浓度范围内以一定的比例间距（几何级差应控制在3.2 倍以内）设置5个7个浓度组，并设立一个空白对照组，使用助溶剂的还应增设溶剂对照组，每个浓度设3个重复。试验观察期为72h，每隔24h取样，在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数，或用分光光度计测定藻的吸光率。用血球计数板时，用一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15%，应予重复计数。依据试验物质性质选择合适的计数方法。5.3数据处理5.3.1生物量增长的抑制百分率处理组铜绿微囊藻生物量增长的抑制百分率按式（1）计算：100=ctcyYY-YI.（1）式中：Iy处理组生物量增长的抑制百分率，以%表示；Yc空白对照组测定的铜绿微囊藻生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）；Yt处理组测定的铜绿微囊藻单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）。5.3.2生长率的抑制百分率处理组铜绿微囊藻生长率的抑制百分率按式（2）计算：100=ctcr-I.（2）全国团体标准信息平台T/ZNX 01820215式中：Ir处理组铜绿微囊藻生长率的抑制百分率，%；c空白对照组生长率的平均值；t处理组生长率的平均值。其中按式（3）计算：ijiji-jt-tXln-Xln=.（3）式中：j-i在时间点i到时间点j之间的平均生长率；Xi在时间点i时的铜绿微囊藻单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）；Xj在时间点j时的铜绿微囊藻单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）。5.3.3半效应浓度按藻类生物量增长的抑制百分率和藻类生长率的抑制百分率分别计算半效应浓度EyC50和ErC50。采用线性刻度坐标，绘制抑制百分率对试验物质浓度的曲线，求出50%活动抑制时的EC50值。5.4质量控制质量控制条件包括：供试生物应是处于对数生长期的纯种藻；对照组和各浓度组的试验温度、光照等环境条件应按要求完全一致；试验起始藻浓度应控制在5106个/mL；试验开始后72h内，对照组藻细胞浓度应至少增加16倍。6试验报告试验报告应包含下列内容：供试物的信息，包括供试农药的通用名、化学名称、结构式、CAS 号、纯度基本理化性质、来源等；供试生物名称、来源、培养基及培养方法；试验条件，包括实验持续时间、温度、光照（光强和光周期）、实验容器（容器、型号、密闭方法）、静置、振荡或通气方式、测试液体积、pH、溶剂及其浓度、铜绿微囊藻生长的测定方法等；供试物的浓度与抑制曲线图，得出的 EyC50、ErC50值，并注明计算方法；观察到的效应：细胞颜色、形态和大小变化；粘连或聚结情况；死亡、抑藻或杀藻效应情况等；试验质量控制条件描述。7结果根据统计结果进行分析评价，用正规格式写出结论报告，并对试验结果加以分析说明，提出应用效果评价（产品特性、关键应用技术、适用时期和剂量方法、药效、药害）的结论性意见，并列出原始数据。全国团体标准信息平台T/ZNX 01820216附录A（资料性）培养基配方表 A.1BG-11 培养基配方序号组分母液浓度母液用量1硝酸钠 NaNO315 g/100 mL 蒸馏水10 mL2磷酸氢二钾 K2HPO42 g/500 mL 蒸馏水10 mL3七水硫酸镁 MgSO47H2O3.75 g/500 mL 蒸馏水10 mL4二水氯化钙 CaCl22H2O1.8 g/500 mL 蒸馏水10 mL5柠檬酸 C6H8O70.3 g/500 mL 蒸馏水10 mL6柠檬酸铁铵 FeC6H5O7NH4OH0.3 g/500 mL 蒸馏水10 mL7EDTA 钠盐 EDTANa20.05 g/500 mL 蒸馏水10 mL8碳酸钠 Na2CO31 g/500 mL 蒸馏水10 mL9A5（Trace mental solution）1 mL/L硼酸 H3BO32.86 g/L 蒸馏水1 mL四水氯化锰 MnCl24H2O1.86 g/L 蒸馏水七水硫酸锌 ZnSO47H2O0.22 g/L 蒸馏水二水钼酸钠 Na2MoO42H2O0.39 g/L 蒸馏水五水硫酸铜 CuSO47H2O0.08 g/L 蒸馏水六水硝酸钴 Co（NO3）26H2O0.05 g/L 蒸馏水将以上各成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转至 1000mL 容量瓶中，定容，经高温灭菌（121，15min），密封并贴好标签，4冰箱保存，有效期 2 个月。该培养基用经高压灭菌（121，15min）的蒸馏水稀释 10 倍后即可使用。全国团体标准信息平台