TCTSS 31-2021 灰茶尺蠖病毒复配剂规模化生产技术规程.pdf

ICS 65.100.10 CCS G 25 团 体 标 准 T/CTSS 31-2021 灰茶尺蠖病毒复配剂规模化生产技术规程 Technical regulations for mass production of Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus compounding agent 中 国 茶 叶 学 会中 国 茶 叶 学 会 2021-07-29 发布 2021-07-30 实施 发 布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草。本文件由湖北省农业科学院果树茶叶研究所提出。本文件由中国茶叶学会标准化工作委员会归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院果树茶叶研究所。本文件主要起草人：谭荣荣、毛迎新、陈娇、陈勋、黄丹娟、王红娟。全国团体标准信息平台 1 灰茶尺蠖病毒复配剂规模化生产技术规程 1 范围 本文件规定了灰茶尺蠖病毒复配剂中主要成分灰茶尺蠖病毒规模化生产方式，主要成分苏云金杆菌生产工艺及病毒复配剂包装、储运等技术要求。本文件适用于灰茶尺蠖核型多角体病毒复配剂的规模化生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 1605 商品农药采样方法 GB 3796 农药包装通则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14825 农药悬浮率测定方法 GB/T 19567.1 苏云金芽孢杆菌原粉 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 灰茶尺蠖核型多角体病毒 Ectropie grisescens Nucleopolyhedrovirus 灰茶尺蠖专性病毒，为不规则的多角体，表面呈皱纹状，高低不平。多角体大小不一致，其直径为 0.9 m1.6 m，包埋多个病毒粒子，由蛋白质组成，不溶于水、乙醇、乙醚、氯仿、苯、丙酮、1 mol/L 盐酸，溶于氢氧化钠、氢氧化钾、氨及硫酸的水溶液和乙酸。3.2 复配剂 compounding agent 由一种以上的农药按一定比例混合在一起制成的农药。它可以与杀虫剂、生长素以及农药增效剂分别相混。4 病毒规模化生产 4.1 人工饲料的制备 将茶叶粉、桑叶粉、酵母粉、大豆粉、胆固醇、Vc 和 Vb 按照 8:3:3:4:0.1:0.5:0.1（质量比）的比例混合均匀后得到混合物 A 备用；将琼脂 1 份，纯水 79 份混合加热溶解，冷却至 50 ，加入苯甲酸钠和苯甲酸（质量比 0.33:0.1），得到混合物 B；将混合物 A 加入混合物 B 中搅拌均匀，放入模具定型。4.2 病毒增殖方式 以感染病毒死亡的典型灰茶尺蠖幼虫尸体为毒源，离心提纯后添食灰茶尺蠖幼虫增殖病毒。以自制 100 孔板为养虫容器，以健康的灰茶尺蠖幼虫为宿主。每孔放人工饲料 0.25 g0.30 g，幼虫 5 头。当灰茶尺蠖幼虫长至 3 龄，添加接种病毒的人工饲料 0.25 g0.30 g，其中病毒接种浓度为 2106 PIB/mL，食完后，按照 0.05 g/虫的食量添加新鲜饲料，直至幼虫化蛹。4.3 病毒提纯 将感染病毒致死的灰茶尺蠖幼虫尸体加适量无菌水置组织匀浆器皿中匀浆 3 min5 min，取出按 1:8 加无菌水混匀后差速离心(先 500 r/min 低速离心 5 min，弃细胞组织碎片和沉淀，取上清液再 3500 r/min 高速离心 30 min，弃上清液，用无菌水重新悬浮沉淀）。差速离心进行 3 次5 次，直至多角体悬浮液呈乳白色。全国团体标准信息平台 2 5 苏云金杆菌生产 砂土孢子斜面培养基 30 培养 72 h，斜面孢子 311 培养 12h15 h，发酵，前期发酵温度28 31，孢子囊明显形成后，3233 种子罐发酵，20%芽孢晶体脱落时放罐，酸化，浓缩。6 病毒复配剂生产工艺 按生产配方单准确称量物料，在剪切机的混合釜中，依次加入去离子水、助悬剂、润湿剂、分散剂、病毒、苏云金杆菌，加完物料后继续剪切 30 分钟以上使其充分混匀；将剪切好的原料打入篮式研磨机中，砂磨 2 h4 h；取样上激光粒度仪检测，至细度达到 LD5020 m；将研磨好的物料打入均质釜中进行均质、熟化。7 复配剂主要成分测定 7.1 病毒浓度测定 将多角体悬液充分混匀，取出 1 mL，用无菌水按 10 倍梯度依次等比稀释 10、102、103、104倍，混匀，用移液管（枪）吸取配制好的悬液置血球计数板上，静止 2 min3 min 后，置光学显微镜下观察计数，分 5 点取样 80 小格（即 5 个中格），选择适当的稀释浓度（以每个中格中多角体数目不超过 40 个为宜）计数多角体，每个血球计数板重复 3 次，取其平均值，按公式（1）计算多角体含量。BAC610480 （1）式中：C多角体浓度（PIB/mL）；A80 个小格中多角体的数量；B稀释倍数。7.2 苏云金杆菌毒蛋白质量分数的测定 毒素蛋白含量用 SAS-PAGE 扫描法进行测定。苏云金杆菌毒素蛋白质量分数 D 按公式（2）计算。100m1221vmvD （2）式中：m1 从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量（ug）；m2 2 mL 稀释液中样品的质量（mg）；v1 样品中最终定容体积（3.75 mL）；v2 注入凝胶上样孔的样品体积（uL）。7.3 复配剂悬浮率的测定 取 5 mL 制剂于 100 mL 三角玻璃瓶中，加入标准硬水 100 mL，充分振荡混匀后转移至 250 mL 具塞容量瓶中，用标准硬水稀释至 250 mL。充分混匀后取 1 uL 试样按照 7.1 中的方法对病毒含量进行测定，取 1 mL 按照 7.2 中的方法对苏云金杆菌毒素蛋白含量进行测定。按照 GB/T 14825 中的计算式分别计算复配剂中病毒和苏云金杆菌毒素蛋白的悬浮率。8 病毒复配剂标志、标签和包装、贮运 8.1 病毒复配悬浮剂的标志、标签和包装应符合 GB 3796 的规定。8.2 常温存放于通风干燥的库房中。贮运时，严防潮湿和日晒，不得与食物、种子、饲料混合，避免和皮肤接触，防止人员口鼻吸入。全国团体标准信息平台 3 附 录 A（规范性）图 A.1 病毒复配剂（茶核苏悬浮剂）生产工艺流程图 图 A.1 茶核苏悬浮剂生产工艺流程图 _ 病 毒 苏云金杆菌 助 剂 合 格 合 格 不合格 不合格 混 合 砂 磨 再混合 均质熟化 检 测 包 装 成品入库 检 测 全国团体标准信息平台