TCI 026-2022 甘蔗白叶病病原检测与抗病性鉴定技术规程.pdf

ICS 65.020CCS B15!#$!#$%&(&%&)*+,-./012-3456789Technical specifications for pathogen detection and disease resistanceidentification of sugarcane white leaf2022-4-20:;2022-4-20?A6BCD:;全国团体标准信息平台!#$%&E&%&IF G前.I1 适范围.12 引标准.13 术语和定义.14 缩略语.15 症状及流特点.26 病原检测.27 抗病性鉴定.3附录A（资料性附录）蔗叶病症状及流特点.6A.1 蔗叶病症状.6A.2 蔗叶病流特点.6A.7A.7附录B（规范性附录）试剂配制和 DNA 提取.7B.1 DNA 提取试剂配制.7B.2 DNA 提取.7B.8B.8附录C（规范性附录）巢式 PCR 检测操作法.8C.1 扩增试剂配制.8C.2 对照.8C.3 引物.8C.4 巢式 PCR 扩增.9C.5 琼脂糖电泳检测与凝胶成像分析.9C.6 蔗叶病植原体巢式 PCR 扩增电泳图.9全国团体标准信息平台!#$%&E&%&I IHHHIII本标准按照 GB/T1.1-2020标准化作导则第 1 部分：标准化件的结构和起草规则起草。本标准由中国国际科技促进会提出并归。某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由云南省农业科学院蔗研究所、临沧南华糖业有限公司、保市农业技术推中、云南省农业科学院物技术与种质资源研究所、耿南华糖业有限公司、临沧市蔗技术推站、澜沧县蔗技术推站、盟县经济作物作站负责起草。本标准主要起草：应昆、李凤、李婕、卢洁、王晓燕、代光伟、段兆祜、张荣跃、单红丽、董有波、丕忠、李银煳、罗志坚、林根、南云刚、李茅苗、岩、红军、唐吉昌、鲁宾、段明雄、升伟、董显华、周中、施永祥、者林成、李富。本标准是次发布。全国团体标准信息平台!#$%&E&%&1)*+,-./012-3456789JKLMN本标准规定了蔗叶病病原检测与抗病性鉴定的术语定义、缩略语、症状及流特点、病原检测与抗病性鉴定的技术法和标准。本标准适于蔗叶病的分检测和蔗种质资源对蔗叶病抗病性的接种鉴定与评价。&OLPQ下列件中的条款，通过本标准的引成为本标准的条款。凡是注期的引件，仅注期的版本适于本件。凡是不注期的引件，其最新版本（包括所有的修改单）适于本件。GB/T 28067蔗叶病毒实时荧光 RT-PCR 检测法R7ST5U3.1 巢式 PCR：巢式 PCR 是种使两对 PCR 引物扩增完整的段，第对 PCR引物扩增段和普通 PCR 相似，第对引物结合在第次 PCR 产物内部，使得次 PCR扩增灵敏度于次 PCR 扩增的变异聚合酶链式反应。3.2 蔗叶病（Sugarcane white leaf,SCWL）：由蔗叶病植原体（Sugarcanewhite leaf phytoplasma）系统性侵染蔗使蔗叶上出现单条或数条条纹，甚全叶变成，叶质柔软，病株分蘖增多并矮缩的种种传植原体病害。3.3 感病对照：受蔗叶病植原体（Sugarcane white leaf phytoplasma）侵染发病株率达 20.1%以上的蔗品种。3.4 抗病对照：受蔗叶病植原体（Sugarcane white leaf phytoplasma）侵染发病株率在 10%以下的蔗品种。VWXSbp：碱基对（base pair）CTAB：六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide）dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合液（Deoxyribonucleoside Triphosphates mixture）ddH2O：双蒸EDTA：胺四酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）Tris-base：三羟甲基氨基甲烷Tris（hydroxymethyl）aminomethane全国团体标准信息平台!#$%&E&%&2TAE：由三羟甲基氨基甲烷、酸和胺四酸组成的缓冲液。YZ_蔗叶病症状及流特点参附录 A。-./0aJ bc1cd仪器与器材包括台式离机、型离机、微量可调移液器、恒温浴锅、旋涡混匀仪、核酸蛋分析仪、PCR 扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、凝胶成像仪、冰箱（温控范围 4和-20）、压灭菌锅、燥箱、液氮罐、电天平、带滤芯移液头、PCR 反应管等。a&ef除另有规定外，所试剂均为分析纯。6.2.1 DNA 提取试剂DNA 提取试剂及配制法附录 B。6.2.2 PCR 试剂PCR 试剂及配制法参附录 B。6.2.3 电泳缓冲液6.2.3.1 50TAE 存储液取 242 g Tris 和 37.2 g EDTA，加约 800 mL ddH2O 充分搅拌溶解；加 57.1 mL冰酸，充分溶解；NaOH 调节 pH 8.3，加去 ddH2O 定容 1000 mL，室温保存。6.2.3.2 1TAE 作液去离将 50TAE 存储液稀释 50 倍制成 1TAE 作液。6.2.4 扩增产物检测试剂琼脂糖、Goldenview 核酸染料、6倍上样缓冲液、DNA 分量标记。aR ghhijk6.3.1 采样具采样具处理按照 GB/T 28067 的要求执。6.3.2 采样法采样法参照 GB/T 28067 的要求执。其中，叶样品采集时选疑似蔗叶病病株，具体参附录 A，样品独分装，编号备。6.3.3 样品保存样品存放与运送按照 GB/T 28067 要求执。全国团体标准信息平台3aVlmn opDNA 提取法参附录 B。aY qr s#t/0巢式 PCR 检测法参附录 C。a uvw5阳性对照有条带，阴性对照和空对照条带时，检测结果有效，当检测结果有效时，依据表 1进结果判定（附录 C）。表 1 判定表目的条带大小（bp）样品阳性对照阴性对照空白对照结果判定1240有有无无含白叶病植原体1240无有无无不含白叶病植原体x2-345xaJ dyz1jk7.1.1 材料选择选择经巢式 PCR 检测不带 SCWL 植原体的成熟健壮蔗茎。7.1.2 对照材料鉴定材料中加蔗品种粤糖 86-368、新台糖 25 号作感病对照，粤糖 83-88、云蔗05-51作抗病对照。7.1.3 材料处理分别切成双芽段，在流动冷中浸泡 48 h 之后，（500.5）热处理 2 h，再 70%噻嗪分散剂和 50%多菌灵可湿性粉剂 1：800液浸种 5 min10 min。7.1.4 壤准备壤经温蒸煮消毒后，按消毒壤和有机肥（3：1）混匀，装（35 cm 30 cm）塑料桶内，装量为桶容量的三分之。xa&|-.从蔗叶病发病区域选择具典型叶病症状的感品种粤糖 86-368 蔗株，经巢式PCR 检测筛选含 SCWL 植原体的蔗茎作接种病原。xaR|接种前通过压榨作接种病原的蔗茎获取携带 SCWL 植原体蔗汁，加为携带 SCWL植原体蔗汁体积 10 倍量的菌稀释混匀，双层纱布过滤，滤液即为 SCWL 植原体全国团体标准信息平台!#$%&E&%&4接种液，现配现。xaV|接种法可选包接种法或切茎接种法。7.4.1 包接种法7.4.1.1 包接种处理好的蔗种置于塑料膜表，按 1000 kg 处理好的蔗种 15 kg 接种液的例，采电动喷雾器将接种液均匀喷洒置于塑料膜表的蔗种，边喷边翻动蔗种，喷完后塑料膜覆盖蔗种，于 25下保湿 24 h。7.4.1.2 材料种植接种后的供试材料分别种植在塑料桶内（35 cm 30 cm），每份供试材料种植 4桶，4 次重复，每桶种植 8芽，共 32芽，置于 2030防温室中培养。7.4.2 切茎接种法7.4.2.1 材料种植处理后的供试材料分别种植在塑料桶内（35 cm 30 cm），每份供试材料种植 4桶，4 次重复，每桶种植 8芽，共 32 芽，置于 2030防温室中培养。接种时每桶选择势较致的 8株，共 32株。7.4.2.2 切茎接种供试材料种植 6个后，在阴天的傍晚灭菌锋利切（或枝剪）把供试材料植株地上部分沿表快速切去，移液枪将 100 L SCWL 植原体接种液滴蔗株根部切上，每份供试材料接种 32株，遮光 24h。接种后置于 2030抗病鉴定防温室中培养观察。xaY-包接种 30 d 和切茎接种 20 d 后，调查各供试材料发病株率，以后每隔 15 d 调查1 次，直感病对照品种发病株率稳定为。记录接种期、接种芽（株）数、出苗数、病害症状始现期、累计发病株数。计算公式：累计发病株率（%）按公式（1）计算：BP=sn1/sn2100%.（1）式中：BP累计发病株率（%）sn1累计发病株数sn2累计总株数xa 2-3按以下分级标准进抗病性评价，表 2。全国团体标准信息平台5表 2 蔗抗叶病鉴定评价标准级别发病株率%抗病性1级0-3.0抗（HR）2级3.1-10.0抗病（R）3级10.1-20.0中抗（MR）4级20.1-40.0感病（S）5级40.1-100感（HS）附录n（资y3附录)*+,-Z_naJ蔗叶病症状全国团体标准信息平台!#$%&E&%&6蔗叶病症状类型可归纳为叶型和草苗型两类。叶型病株叶表现为叶质柔软，叶绿素含量减少化，化症状可分为整叶化、呈条纹状化或呈斑驳状化。草苗型病株茎部现条纹，分蘖明显增多，病株矮缩，茎细，节间缩短，顶部叶丛，外观如草苗。草苗型病株和叶型病株常混合出现，这种混合型病株最容易枯死，即使成活也常不成茎。仅叶化分蘖过多的病株虽可枯死，但不枯死的病株可恢复，有些恢复例也较，有些甚恢复到与健株外观难以区别，但到宿根蔗再现典型症状，图 A.1。CABD图 A.1叶病症状A：病叶；B：叶型病株；C：草苗型病丛；D：病na&蔗叶病流特点蔗叶病（Sugarcane white leaf,SCWL）是由 16SrXI 组中的蔗叶病植原体（Sugarcane white leaf phytoplasma）引起的种检疫性蔗重要病害。SCWL 植原体为细胞壁原核微物，尚不能在培养基离体培养，潜育期较，最短的约为 30 天（少数），般为 23个，有的甚达年之久。寄主主要有蔗（Saccharum officinarum）、狗根(Cynodondactylon)，别名：百慕草（Bermuda grass）。SCWL 植原体存在于病株韧部筛管中，蔗是性繁殖作物，SCWL 可通过带病蔗种进远距离传播，且传播性极强。此外，SCWL 在间还可通过细针叶蝉（Matsumuratettix hiroglyphicus Matsumura）和条纹闭颜叶蝉（Yamatotettix flavovittatusMatsumura）传播。病蔗留种，特别是基部数节留种，出的幼苗乎全为病苗，萌发后 1 个左右就死亡。病害的发受品种抗性，种蔗带毒率、传毒媒叶蝉的数量及环境条件等诸因素的影响。如品种度感病，种蔗带毒率，加上环境条件有利于介体昆的繁殖和传毒活动，则病害往往发较重，反之则发较轻。宿根蔗般新植蔗发病重。全国团体标准信息平台7AA附录（8M3附录ef配T DNA opaJDNA 提取试剂配制DNA 提取试剂配制法表 B.1。B.12 CTAB o组分配制量（L）配制法1.0 molL-1Tris-HCl（pH8.0）液1称取 121.0 g Tris，溶解于 800 mL 的 ddH2O 中，6molL-1的 HCl 调节 pH 8.0 后，ddH2O 定容到 1.0L。0.5 molL-1EDTA（pH8.0）的液1称取 186.0 g Na2EDTA2H2O，加 800 mL ddH2O，充分搅拌，2 molL-1的 NaOH 调节 pH 8.0 后，ddH2O 定容到 1.0 L。2倍 CTAB 抽提缓冲液1依次加 20 g 的 CTAB 粉末，100 mL 的 1.0 molL-1的Tris-HCl（pH 8.0）液，40 mL 的 0.5 molL-1