SNT 5337-2021 动物疫病传播媒介蜱种类鉴定技术规范.pdf

以正式出版文本为准I C S1 1.2 2 0C C SB4 1中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 3 72 0 2 1 动物疫病传播媒介蜱种类鉴定技术规范Q u a r a n t i n e p r o t o c o l f o r s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n f o r t i c k v e c t o r s t r a n s m i t t i n g a n i m a l d i s e a s e s2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国温州海关、中华人民共和国上海海关。本文件主要起草人:吕继洲、王素华、吴绍强、李树清、林祥梅、袁向芬、王慧煜、邓俊花、王彩霞。S N/T5 3 3 72 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准 动物疫病传播媒介蜱种类鉴定技术规范1 范围 本文件规定了动物疫病传播媒介蜱的采集、保存、形态学鉴定以及D NA条形码鉴定方法。本文件适用于动物疫病传播媒介蜱的种类鉴定,可辅助应用于相关动物疫病的监测与防控。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。C O I:细胞色素c氧化酶亚基I(C y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I);D NA:脱氧核糖核酸(D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d);d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(D e o x y-r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e);P C R:聚合酶链式反应(P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n);S D S:十二烷基硫酸钠(S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e)5 样品采集5.1 试剂与材料5.1.1 干冰。5.1.2 乙醚(或松节油、煤油、三氯甲烷等)。5.1.3 无水乙醇。5.1.4 橡胶手套。5.1.5 5 0 m L离心管与1 5 m L 离心管。5.1.6 白绒布(长5 0 c m1 0 0 c m,宽2 5 c m1 0 0 c m)。5.1.7 离心管。5.1.8 吸水纸。1S N/T5 3 3 72 0 2 1以正式出版文本为准5.2 设备与仪器5.2.1 聚苯乙烯塑料杯(5 0 0 m L)。5.2.2 不锈钢诱捕装置(3 0 c m4 5 c m8 c m)。5.2.3 真空吸尘器。5.3 采集方法5.3.1 防护要求5.3.1.1 应穿浅色、表面光滑实验服,扎紧裤腿或把裤腿塞进鞋袜里,穿靴子,戴橡胶手套。5.3.1.2 裸露皮肤应涂抹趋避剂如避蚊胺等。5.3.1.3 帐篷等露营装备应用杀虫剂浸泡。5.3.1.4 避免在蜱栖息地如草地、树林等环境中长时间坐卧。5.3.1.5 野外活动结束后应检查衣物上是否有蜱,一旦发生蜱叮咬,不可用手强行拔除,应用乙醚等处理蜱使其自行从身上脱落,尽快就医。5.3.2 畜禽体上蜱的采集 在牛、羊、犬、禽等动物身上采集蜱,动物身下铺放白布。用准备好的乙醚(或松节油、煤油、三氯甲烷)涂抹蜱头部,等待数分钟,蜱自行从动物身上脱落。用镊子摘取脱落蜱,放置到离心管中。5.3.3 周围环境中蜱的采集 在经常放牧的草地、野生动物巢穴、家养畜舍地面及墙缝内采集蜱。方法如下:a)手工采集法:通过手工挖开野生动物巢穴、家养畜舍居住地里缝隙或洞穴中的泥土,通过肉眼观察,用镊子采集蜱。b)二氧化碳诱捕法:使用不锈钢装置,放置一个装满干冰的聚苯乙烯塑料杯(5 0 0 m L)。不锈钢装置放置于蜱出入区域的地面,用泥土将诱捕器的表面覆盖,人即离开,在几个小时或过夜后回来收集蜱。c)真空吸尘法:在野外大批量收集蜱时,用真空吸尘器在圈舍、草地或灌木丛中吸取样品,检查真空吸尘器桶体,用镊子夹取蜱收集于离心管中。d)布旗法:白绒布一边穿入木棍,在木棍两端系以长绳,在草地上或灌木从中拖动,草地以及灌木上的蜱即可附着在旗面上,检查并用镊子收集于离心管中。5.4 样品运输及保存5.4.1 将采集的活蜱放入1 5 m L或5 0 m L 离心管中,管中宜放置浸水的吸水纸、棉花等,常温运输,2 4 h内送入实验室。容器上应附有采集标签,注明采集地点、日期、宿主、生境、海拔、经纬度、采集人等信息。5.4.2 活蜱先放入7 0 8 0 热水中杀死,用吸水纸吸干体表水分,放入1.5 m L离心管中,放置在-8 0 冰箱保存。6 形态学鉴定6.1 试剂与材料6.1.1 灭菌双蒸水(应符合G B/T 6 6 8 2 中一级水的规格,按照A.8配制)。2S N/T5 3 3 72 0 2 1以正式出版文本为准6.1.2 无水乙醇。6.1.3 手套。6.1.4 吸水纸。6.2 设备与仪器体视显微镜。6.3 形态学观察6.3.1 未经-8 0 保存的蜱,直接放置在体视显微镜下观察。6.3.2-8 0 保存的蜱,可放在常温双蒸水中浸泡1 5 m i n后,吸水纸吸干体表水分后观察。6.3.3 观察蜱的背面观、腹面观、假头基、须肢、肛沟等,再观察气门板、生殖孔、哈氏器等形态学特征部位。蜱具体形态特征部位参见附录B。6.4 蜱的形态学种类判定6.4.1 蜱可鉴定到属,具体按照附录C鉴定。6.4.2 蜱可根据典型形态特征鉴定到种,具体形态特征按照附录D鉴定,其他种蜱则需采用分子生物学方法进行种类的鉴定。7 D N A条形码鉴定7.1 试剂与材料除特别说明以外,本文件所用试剂均为分析纯,试验用水应符合规范性引用文件的规定。7.1.1 无水乙醇。7.1.2 蛋白酶K(2 0 mm o l/L)。7.1.3 5 0T A E缓冲液(试剂配制按照A.1)。7.1.4 阳性对照(长角血蜱的基因组D NA,按照A.2)。7.1.5 T i r s-H c l缓冲液(试剂配制按照A.3)。7.1.6 生理盐水(试剂配制按照A.4)。7.1.7 E D T A溶液(试剂配制按照A.5)。7.1.8 T E S缓冲液(试剂配制按照A.6)。7.1.9 1 0%S D S溶液(试剂配制按照A.7)。7.1.1 0 氯化钠。7.1.1 1 三氯甲烷。7.1.1 2 异丙醇。7.1.1 3 冰乙酸。7.1.1 4 T r i s 饱和酚。7.1.1 5 7 0%乙醇。7.1.1 6 G o l d v i e w 核酸染料。7.1.1 7 T a q D NA聚合酶。7.1.1 8 d NT P(2.5 mm o l/L)。7.1.1 9 琼脂糖。7.1.2 0 灭菌双蒸水(应符合G B/T 6 6 8 2 中一级水的规格,按照A.8配制)。7.1.2 1 引物。3S N/T5 3 3 72 0 2 1以正式出版文本为准 L C O 1 4 9 0:5-G G T C AA C AAAT C AT AAAGAT AT T G G-3 HC O 2 1 9 8:5-T AAA C T T C AG G G T GA C C AAAAAAT C A-3 用双蒸水将引物稀释为2 0 m o l/L工作浓度,-2 0 保存备用。预期扩增片段长度为6 7 0 b p,引物合成后采用灭菌双蒸水稀释为1 0 m o l/L。7.2 设备与仪器7.2.1 常规 P C R仪。7.2.2 组织研磨器。7.2.3 超净工作台。7.2.4 制冰机。7.2.5 高速冷冻离心机。7.2.6 水浴锅。7.2.7 台式小型离心机。7.2.8 常规冰箱。7.2.9 旋涡振荡器。7.2.1 0 电泳仪。7.2.1 1 凝胶成像系统。7.2.1 2 微量可调移液器(1 0 L、1 0 0 L、1 0 0 0 L)及配套吸头。7.3 检测方法7.3.1 D N A提取 使用完整或不完整的成年蜱、幼蜱、若蜱、蜱卵样品。蜱样品用双蒸水冲洗后,用液氮冻后研磨,提取待检组织基因组D NA,按照附录E提取组织D NA的方法,也可采用商品化的组织基因组D NA提取试剂盒进行。7.3.2 P C R反应体系 在P C R管内,加入1 0P C R缓冲液2.5 L,5 U/L T a q D NA聚合酶0.5 L,1 0 m o l/L上下游引物各0.5 L,1 0 mm o l/L d NT P s 2 L,模板D NA 2 L,补充灭菌双蒸水至2 5 L。7.3.3 P C R扩增程序 9 5 预变性5 m i n;之后9 5 变性3 0 s,5 0 退火3 0 s,7 2 延伸1 m i n,共4 0个循环;最后7 2 延伸1 0 m i n。P C R阳性对照:取-8 0 保存蜱基因组D NA。P C R阴性对照:加水替代基因组D NA。7.3.4 琼脂糖凝胶电泳 取5 L样品P C R扩增产物,进行1%2%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后,用凝胶成像仪或者紫外透射仪观察结果。7.3.5 结果判定7.3.5.1 阳性对照有6 7 0 b p的扩增条带,同时阴性对照没有相应条带,判定试验成立;否则试验无效,需分析并排除引起试验无效的因素,并重新试验。4S N/T5 3 3 72 0 2 1以正式出版文本为准7.3.5.2 在阳性、阴性对照都成立的前提下,若检测样品有6 7 0 b p的条带,则试验阳性;若检测样品无6 7 0 b p条带,则试验阴性。7.3.5.3 对试验成立且有6 7 0 b p阳性条带的样品,进行测序。7.3.5.4 将P C R扩增后测序的C O I序列与条形码系统B O L D S Y S T EM中数据库中序列进行比对,排位第一的序列为蜱序列,且序列相似度9 7%,可判定蜱种。8 结果综合判定8.1 根据典型形态特征能够鉴定到种的样品,直接判定蜱种。8.2 对于本身缺乏典型形态特征或部分典型特征的样品,应结合分子生物学D NA条形码方法结果进行蜱种鉴定。5S N/T5 3 3 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A(规范性)试剂的配制A.1 5 0T A E电泳缓冲液 T r i s 2 4 2.0 g N a2E D T A2 H2O3 7.2 g 冰乙酸5 7.1 m L 双蒸水定容至1 0 0 0 m L 充分溶解,室温保存A.2 阳性对照 取蜱(成虫、若虫、幼虫、卵)等,应用本文件7.3中D NA提取方法或商品化D NA提取试剂盒,提取基因组D NA,使用5 0 L 灭菌双蒸水溶解或洗脱基因组D NA,-8 0保存。A.3 1 m o l/L T r i s-H C l缓冲液(p h=8.0)4 0 m L双蒸水,6.0 5 7 g固体T r i s放入烧杯中溶解,用浓盐酸调p h值到8.0,转移到5 0 m L容量瓶中,加入双蒸水定容,摇匀后,转到准备好的溶液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温,4 保存备用。A.4 0.8 5%N a C l溶液(生理盐水)在2 0 m L双蒸水中溶解0.8 5 g固体N a C l,加水定容至1 0 0 m L,摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温,4 保存备用。A.5 0.5 m o l/L E D T A溶液(p h=8.0)将9.0 8 g的N a2E D T