TCAQI 159-2020 食品及食品包装表面中新型冠状病毒采样与实时荧光 RT-PCR 检测方法.pdf

ICS 67.050 C53 食品及食品包装表面中新型冠状病毒采样与实时荧光 RT-PCR 检测方法 Sampling and Real-time RT-PCR assay for detection of SARS-CoV-2 in food and food packaging surface 2020-12-30 发布 2021-01-20 实施 T/CAQI 159-2020 中国质量检验协会中国质量检验协会 CAQI 团团 体体 标标 准准 发布 全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 II 目 次 前 言.III 引 言.IV 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂.1 5 仪器设备.2 6 操作步骤.2 7 结果分析.3 8 实验室安全.3 附录 A.5 附录 B.6（English Version）.7 全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 III 前 言 本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利，本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本文件由中国检验检疫科学研究院综合检测中心提出，由中国质量检验协会归口。本文件主要起草单位：中国检验检疫科学研究院综合检测中心、湖南赫西仪器装备有限公司、安徽拓维检测服务有限公司、赫斯缇亚(北京)生物科技有限公司、北京森康生物技术开发有限公司、上海华测品标检测技术有限公司、北京戴纳实验科技有限公司、广州华腾生物医药科技有限公司、吉林大学、军事医学科学院军事兽医研究所、润方（长春）生物科技有限公司、鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司、中国检验检疫科学研究院卫生检验检疫研究所、中国海关科学技术研究中心、北京服装学院、新疆塔里木大学、新疆大学、中检科创（北京）测试认证有限责任公司、国正检验认证有限公司、CAIQTEST Malaysia SDN BHD（马来西亚）、北京卓诚惠生生物科技股份有限公司、CLUB DAMIS SINO CONGOLAIS（刚果金）、GENESEQ SDN BHD（马来西亚）、LAB-IND RESOURCE SDN BHD（马来西亚）、北京化工大学环渤海生物产业研究院、北京洛奇医学实验室股份有限公司、溯源生命生物工程股份有限公司、天津海关动植物与食品检测中心、北京市餐饮行业协会、北京包装饮用水行业协会、中检科（北京）测试技术有限公司、CLUB DES AMIS SINO-BURKINABE（布基纳法索）。本文件主要起草人：乐粉鹏、刘键、李强、丁凯、寻继勇、迟海鹏、李建华、柴平海、魏晓宏、夏志平、谢水林、房恒通、焦虎平、王梓、袁吉泽、李洋、胡孔新、刘丽娟、江丽、龚、周立成、CHNG SOO EE、郭汉文、吕小毅、杨洁、张家兵、张婵、云环、付文钰、万笑宇、何健、袁常柱、吴博隆、刘旸、安少宁、ILITO LOFONGO Daddy Patrick、GAN HAN MING、LIEW SHYUE YIH、任宝刚、王芳、罗艳娟、辛明亮、袁军、王斌、李杰光、赵亚洲。本文件主要专家组成员：张传福、李仁清、高丽娟、张磊、聂会忠。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 IV 引 言 2019年12月以来，全世界爆发新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），简称“新冠肺炎”，新冠肺炎传播途径主要为呼吸道飞沫传播和接触传播，呼吸道飞沫传播可以通过佩戴口罩来进行阻断，人体、环境以及食品的直接接触成为造成新冠肺炎传播的潜在风险。2020年1月12日，世界卫生组织正式将2019新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2。本文件在满足 新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（国卫办疾控函 2020156号）的前提下，进一步规范食品及食品包装表面中新冠病毒的采样及检测方法。目前国内尚未建立食品及食品包装表面中新型冠状病毒采样及检测的相关标准，本文件的推出将填补国家在食品及食品包装表面中采集及检测新冠病毒标准的空白，形成统一的采样和核酸检测操作规程。本文件中涉及到的实验室生物安全要求及人员防护要求应按照 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）、新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）等相关国家规定执行。高风险地区样品采集及检测工作应在当地实验室进行，防止样品跨区域运输产生污染。当使用本文件方法检测出阳性样品，应履行国家相关管理要求。全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 1 食品及食品包装表面中新型冠状病毒采样与实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了食品及食品包装表面新型冠状病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法。其中包括术语、检测试剂、仪器设备、实验操作步骤、结果分析、实验室生物安全等。本文件适用于食品及食品包装表面中新型冠状病毒的检测，包含水产品（含活水生动物）表面、其他动物类产品表面、植物类食品表面、内外包装表面。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）（联防联控机制医疗发2020271 号）新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）（国卫办科教函202070 号）农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范（联防联控机制综发2020221 号）新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（国卫办疾控函2020156 号）特定场所消毒技术方案（国卫办疾控函2020156 号）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 实时荧光 RT-PCR 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应。3.2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3 RNA 核糖核酸。3.4 PBS 磷酸盐缓冲盐水。4 试剂 4.1 样品采集试剂 全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 2 病毒采样液可选择以下试剂：组织培养液（MEM、RPMI1640 培养液等）、缓冲液（HANKS 液、PBS 缓冲液等）、添加有 RNA 稳定剂的溶液、等渗液（生理盐水等）或商品化采样试剂盒。（建议直接选取商品化无菌病毒采样管，内含采样拭子）。4.2 RNA 提取试剂 选取商品化的病毒 RNA 提取试剂盒或 TRIzol RNA 提取试剂。4.3 消毒剂 75%乙醇、有效氯浓度 0.2%的消毒剂或其他有效消毒剂。5 仪器设备 5.1 荧光 RT-PCR 检测仪。5.2 高速离心机：转速4000r/min。5.3 混匀器。5.4 冰箱（28和-20两种）。5.5 微量可调移液器（5L，10L，100L，1000L）及配套带滤芯吸头。5.6 水浴锅。5.7 生物安全柜。5.8 核酸提取仪（可选）。5.9 乙醇水分含量的快速测定仪（可选）。5.10 集成式核酸检测实验室（可选）。6 操作步骤 6.1 样品采集 样品采集方法详见附录 A 执行。6.2 检测样本包装、标识、储存和运输 6.2.1 检测样本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类名称及采样日期。6.2.2 将密闭后的标本装入密封袋，每袋限一份样本。6.2.3 将装有检测样本的密封袋放入到样本盛放容器内，保持采样管垂直放置。将检测样本装入生物安全转运箱冷链转运，用有效消毒剂喷洒消毒生物安全转运箱外表面。6.2.4 采集的检测样本应尽快送至检测实验室，置于 4中可保存 24h；24h 内无法检测的样本则应置于-70或以下保存（如无-70保存条件，则于-20冰箱保存不超过 48h）；样本运送期间应避免反复冻融。6.2.5 样本运输应符合新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（国卫办疾控函2020156 号）中相关要求。6.3 样品处理 全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 3 提前将水浴锅预热至 56，在生物安全柜内用有效消毒剂对装有样本的密封袋外表面进行喷洒消毒，用吸水纸擦拭后放入水浴锅中的试管架上，样本盖上搁置重物，防止样本采集管漂浮。每隔 10min 将样本摇匀 1 次（动作轻柔），灭活时间 30min 后备用。6.4 病毒 RNA 的提取 取出样本，4000r/min 离心 5min 后冰浴 3-5min，在生物安全柜内打开样本采集管，按核酸提取试剂说明书要求吸取一定量样本（动作轻柔）加入核酸提取试剂中。参照 RNA 核酸提取试剂盒说明书，在生物安全柜内加入细胞病毒裂解液。核酸提取流程参考相关厂家试剂盒说明，样本量大的实验室使用通量适宜的核酸提取仪，以提高检测效率。6.5 体系配置 在体系配置区，按照商品化检测试剂盒说明书进行体系配制。每批检测应设置阴性对照、阳性对照及试剂盒质控品。6.6 实时荧光 RT-PCR 反应条件 实时荧光 RT-PCR 反应条件参考相关厂家商品化核酸检测试剂盒说明书。7 结果分析 推荐选用针对新型冠状病毒的 ORF1ab、N 基因、E 基因区域的引物和探针（靶标引物和探针参考附录 B）。7.1 实验成立条件 阳性对照 Ct 值37 并出现典型的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无典型的扩增曲线，实验结果成立。7.2 阈值设定 阈值线设定于刚刚超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整，或参照商品化核酸检测试剂盒说明书。7.3 结果判定 结果分为“阳性”、“阴性”2 种。实时荧光 PCR 检测结束后，在阴性对照、阳性对照和质控都成立的前提下，根据检测样本扩增的荧光曲线和 Ct 值来分析。阴性:无 Ct 值或 Ct40。阳性：Ct 值37，可报告为阳性。灰度区：Ct 值在 37-40 之间，建议重复实验，若重做结果 Ct 值40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。注：如果用的是商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。8 实验室安全 8.1 生物安全 实验室安全级别参照新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）的相关内容进行全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 4 管理。8.2 实验室设备使用安全 离心机建议使用生物安全离心机并装有不平衡量振动显示及报警，并可设定报警不平衡量，以免影响实验结果，以及对实验人员造成伤害。8.3 消毒液使用安全 消毒液使用参考特定场所消毒技术方案（国卫办疾控函2020156 号），实验室如采用 75%乙醇消毒液，使用前建议实验室采用乙醇水分含量的快速测定仪测定乙醇浓度后再使用。全国团体标准信息平台T/CAQI 159-2020 5 附录附录 A A （规范性附录）样品采样方法 A.1 食品表面 A.1.1 水产品（含活水生动物）表面 A.1.1.1 对其表面进行涂抹采样，采样拭子涂抹范围除动物外表面外，还应深入包括口腔、腮、泄殖孔、贝壳内部等天然孔隙内进行涂抹采样；对于已经分割的水产品，还要对水产品的断面进行涂抹采样。A.1.1.2 取浸有无菌生理盐水或 PBS 的一次性长柄拭子，或打开采样试剂包装，取出采样拭子，将拭子伸入采样管的样品保存液中，提起，离开液面，在采样管壁轻轻挤掉多余采样液，用拭子在包装表面选择采样的位置横竖往返各涂抹 5 次以上，并随之用手指捻转拭子。A.1.1.3 将拭子插入装有 3.0mL 样品保存液的采样管中，拭子离采样管底约 1cm 时，弯曲折断采样拭子柄，盖好采样管盖子，做好记录，完成采样。A.1.2 其他动物类产品表面 A.1.2.1 对于其他动物胴体对其表面进行涂抹采样，采样拭子涂抹范围除动物外表面外，还应深入包括口腔及其他可探及腔隙进行涂抹；对于分割动物产品、蛋类以及动物油脂，应直接在其表面进行涂抹采样。A.1.2.2 涂抹步骤同 A.1.1.2 A.1.2.3 操作步骤同 A.1.1.3 A.1.3 植物类食品表面 A.1.3.1 对其表面包括表面缝隙进行涂抹采样。A.1.3.2 取浸有无菌生理盐水或 PBS 的一次性长柄采样拭子，在各部分表面横竖往返各涂抹 5