SNT 4624.20-2021 入境环保用微生物菌剂检测方法 第20部分：泛养副球菌.pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.202021入境环保用微生物菌剂检测方法第 20 部分：泛养副球菌Test method of import microbe agentia in the environment protection-Part 20:Paracoccus pantotrophus2021-06-18 发布2022-01-01 实施ICS 11.020CCS C 62中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1 字数 31 千字2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷印数 1500书号：155175327 定价 18.00 元入境环保用微生物菌剂检测方法 第 20 部分：泛养副球菌行 业 标 准SN/T4624.202021*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7531中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址 4624.202021I前 言本文件按照 GB/T1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件为 SN/T4624入境环保用微生物菌剂检测方法的第 20 部分。SN/T4624 已经发布了以下部分：第 1 部分：地衣芽孢杆菌第 2 部分：短小芽孢杆菌第 3 部分：巨大芽孢杆菌第 4 部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌第 5 部分：型溶血性链球菌第 6 部分：金黄色葡萄球菌第 7 部分：沙门氏菌第 8 部分：志贺氏菌第 9 部分：致泻大肠埃希氏菌第 10 部分：淡紫拟青霉第 11 部分：雅致小克银汉霉第 12 部分：哈茨木霉第 13 部分：黄孢原毛平革菌第 14 部分：焦曲霉第 15 部分：解淀粉芽孢杆菌第 16 部分：类产碱假单胞菌第 17 部分：恶臭假单胞菌第 18 部分：短短芽孢杆菌第 19 部分：红串红球菌第 20 部分：泛养副球菌本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国沈阳海关、诺微信（沈阳）生物技术有限公司。本文件主要起草人：王金玲、张莹、李秀峰、王旭、于丽、张淼以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 4624.202021入境环保用微生物菌剂检测方法 第 20 部分 泛养副球菌1 范围本文件规定了入境环保用微生物菌剂泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus）的检测方法。本文件第一法适用于入境环保用微生物菌剂泛养副球菌的定性检测；第二法适用于入境环保用微生物菌剂中泛养副球菌的定量检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 泛养副球菌分类地位学名：Paracoccus pantotrophus。曾用名：Thiosphaera pantotropha。分类地位：科（aerobicchemolithotrophicbacteriaandassociatedorganism），球硫细菌属（Thiosphaera）。5 方法原理分离纯化菌株后，进行形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光 PCR 检测，根据菌的形态特征结果、生化鉴定结果、实时荧光 PCR 特异性片段扩增结果，3 项结果都符合时判断该菌为目标菌株。6 主要仪器和设备6.1 电子天平（感量 0.01g）。6.2 恒温培养箱：35 1。6.3 恒温振荡培养箱：35 1。6.4 腕式振荡器。6.5 恒温水浴锅。6.6 台式冷冻离心机（最高转速 15000r/min）。以正式出版文本为准2SN/T 4624.2020216.7 实时荧光 PCR 扩增仪。6.8 生物显微镜：10100。6.9 微量移液器和灭菌吸头：10L、20L、200L、1000L。6.10 高压灭菌锅。6.11 PCR 超净工作台。6.12 电泳仪。6.13 核酸/蛋白分析仪。6.14 凝胶成像系统。6.15 无菌培养皿：直径 90mm。7 主要试剂和培养基7.1 实验用水（应符合 GB/T6682 中一级水的规格）。7.2 磷酸盐缓冲液：按附录 A 中 A.1 配制。7.3 硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂：按附录 A 中 A.2 配制。7.4 接触酶：按附录 A 中 A.3 配制。7.5 氧化酶：按附录 A 中 A.4 配制。7.6 甲基红试验：按附录 A 中 A.5 配制。7.7 糖发酵管：按附录 A 中 A.6 配制。7.8 硝酸盐还原试验培养基：按附录 A 中 A.7 配制。7.9 淀粉水解试验培养基：按附录 A 中 A.8 配制。7.10 TE 缓冲液（pH 值 8.0）：按附录 A 中 A.9 配制。7.11 1%3%琼脂糖凝胶：按附录 A 中 A.10 配制。7.12 25mMEDTA：按附录 A 中 A.11 配制。7.13 3M 醋酸钠：按附录 A 中 A.12 配制。7.14 dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。7.15 TBE：按附录 A 中 A.13 配制。7.16 TaqDNA 聚合酶。7.17 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。7.18 琼脂糖。7.19 溴化乙锭。7.20 DNA 分子量标记：100bpDNAladder。第一法 泛养副球菌定性检测8 样品制备、培养8.1 以无菌操作称取 1g（mL）样品加入到 99mL 无菌磷酸盐缓冲液中，在室温下用腕式振荡器震荡 10min，振荡器震荡速率 300次/min400次/min，制成 1:100 的样品匀液。取样过程中，在样品旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白对照。8.2 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:100 样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9mL 无菌磷酸盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，并在振荡器上进行振摇，至少振摇 15s，制成 1:1000 的样品匀液。以正式出版文本为准3SN/T 4624.2020218.3 按8.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。8.4 根据对样品菌量的估计，选择 2 个 3 个适宜稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别移取 1 环菌连续划线接种 5 个硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂平板，35 1培养48h。取样过程中，在样品旁边放置 1 个营养琼脂平板作为空白对照。9 形态学鉴定9.1 培养性状泛养副球菌在硫酸链霉素胰蛋白胨大豆琼脂上的菌落圆形、颜色大多数为白色、淡黄色，表面光滑，边缘整齐。9.2 形态特征革兰氏染色：将 8.4 中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。泛养副球菌为革兰氏阴性短杆状或球形、近球形的菌，不运动，不形成芽孢。10 生化鉴定 也可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等。取 8.4 中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入 100L 增菌肉汤。泛养副球菌生化特征见表 1。表 1 泛养副球菌生化特征鉴定项目泛养副球菌接触酶+氧化酶+甲基红试验甘露糖葡萄糖-硝酸盐还原+/-淀粉水解11 分子生物学检测11.1 细菌模板 DNA 的提取11.1.1 直接提取法取 8.4 中菌液 1mL 加到 1.5mL 无菌离心管中，10000r/min 离心 2min，尽量弃净上清液（如果肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE100L、10mg/mL 溶菌酶 100L，37温育 30min，12000r/min 离心 2min，沉淀加入 TE 缓冲液 600L 重悬，再加入 15mg/mL 蛋白酶25L，55温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清液保存于-20保存以待检测。11.1.2 有机溶剂提取法取 8.4 中菌液 1mL 加到 1.5mL 无菌离心管中，10000r/min 离心 2min，尽量弃净上清液（如果肉眼观察沉淀量不可见或较少时，可重复此步操作）。沉淀加入 TE 缓冲液 570L 重悬，然后以正式出版文本为准4SN/T 4624.202021加入 10mg/mL 溶菌酶 100L，37温育 30min，再加入 10%SDS30L，65温育 10min，加入等体积的酚混匀，12000r/min 离心 10min，取上清液移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清液加等体积的酚氯仿（11，体积比）混匀，12000r/min 离心 10min，取上清液再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10 体积的 3mol/L 乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min 离心10min，弃上清液，沉淀用 500L75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入100L 无菌水（预先加热至 65有利于 DNA 溶解），-20保存以待检测。11.1.3 试剂盒法使用商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。11.1.4 DNA 质量检测用核酸/蛋白分析仪分别在 260nm 和 280nm 下测定 OD 值，用于实时荧光 PCR 反应的 DNA 纯度一般为 1.6 OD260/OD280 2.0。DNA纯度=OD260/OD280DNA浓度（mg/mL）=50OD26011.2 实时荧光 PCR 鉴定11.2.1 引物和探针序列引物和探针序列见表 2。其中探针的 5 端标记 FAM，3 端标记 TAMRA。表 2引物和探针序列鉴定菌名称引物序列探针序列泛养副球菌(ccdA)GenBankAF308446.15-CAGCCTTCCACGAAAGAGTGA-35FAM-CCCTTTCCATGAGCCAA-TAMRA35-GCATCTGCAAGCTCGATTCC-311.2.2 实时荧光 PCR 反应体系实时荧光 PCR 反应体系见表 3。表 3实时荧光 PCR 反应体系试剂名称实时荧光 PCR反应体系2.5RealMasterMix12.5L正向引物（10pmol/L）1L反向引物(10pmol/L)1L探针(5pmol/L)1LDNA 模板2L（约 50ng200ng）50ROXReferenceDye*30.25LddH2O补充至 25L注 1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注 2：50ROXReferenceDye*3荧光试剂仅在具有 ROX 校正通道的实时荧光 PCR 仪上进行扩增添加，否则用 超纯水补足。注 3：检测样品设置两个平行反应。以正式出版文本为准5SN/T 4624.20202111.2.3 实时荧光 PCR 反应参数实时荧光 PCR 反应参数见表 4。表 4 实时荧光 PCR 反应参数循环步骤温度/时间内容119415min起始模板变性402943sPCR 循环中模板变性35632s退火延伸注 1：使用不同实时荧光 PCR 仪，可对参数作适当调整。注 2：设置实时荧光 PCR 反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪 器使用说明书。11.2.4 空白对照、阴性对照和阳性对照设置11.2.4.1 阴性对照：非泛养副球菌 DNA 为模板。11.2.4.2 阳性对照：已知泛养副球菌的 DNA 或含有待测基因序列的质粒为模板（见附录 B）。11.2.4.3 空白对照：设两个，一是提取 DNA 时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光 PCR 反应的空白对照。11.2.5 实时荧光 PCR 扩增结果判定11.2.5.1 对照结果11.2.5.1.1 阴性对照：无扩增曲线。11.2.5.1.2 阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应 30.0。11.2.5.1.3 空白对照：无扩增曲线。1