TZNZ 029-2020 水产品中喹诺酮类药物残留的快速检测 胶体金免疫层析法.pdf

T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T/ZNZ 0292020 水产品中喹诺酮类药物残留的快速检测 胶体金免疫层析法 Rapid detection of quinolones residues in aquatic products -Colloidal gold immunochromatographic method 2020-09-15 发布 2020-10-15 实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 ICS 65.060.99 B 90 全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020给出的规则起草。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站、杭州市农业科学研究院、杭州南开日新生物技术有限公司、北京六角体科技发展有限公司。本文件主要起草人:王扬、柯庆青、柳爱春、桑丽雅、贝亦江、何欣、王鼎南、周钦、孔俏丹、丁雪燕。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 1 水产品中喹诺酮类药物残留的快速检测 胶体金免疫层析法 1 范围 本文件规定了水产品中喹诺酮类药物残留的免疫胶体金快速筛查检测方法。本文件适用于鱼、虾、蟹、龟鳖、贝类等水产品肌肉等可食部分中喹诺酮类药物残留的快速筛查检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30891-2014 水产品抽样规范 农业部1077号公告-1-2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 3 术语及定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 本方法应用竞争抑制免疫层析原理。试样中喹诺酮类药物，经有机试剂提取、净化、吹干、复溶后后滴加在喹诺酮类免疫胶体金快速检测试剂条加样孔中，样品中喹诺酮类药物与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，未被喹诺酮类药物结合的抗体与检测线（T线）上的抗原反应显色，已与喹诺酮类药物结合的金标抗体则不能与检测线上的抗原结合，通过T线后，与控制线（C线）上的二抗反应显色。用胶体金读卡仪或目测比较板上控制线（C线）和检测线（T线）上红色条带的有无及颜色相对深浅，对样品中喹诺酮类药物含量进行定性判定。图1 免疫胶体金快速检测试剂条测定示意图 全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 2 5 试剂和材料 5.1 乙腈（C2H3N）5.2 正己烷（C6H14）5.3 PBST 缓冲液：溶解 8.0 g 氯化钠、0.2 g 氯化钾、1.44 g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)、0.24 g 磷酸二氢钾、0.5 mL 吐温-20 于 800 mL 水中，加水溶解并定容至 1000 mL，经 121灭菌 15 min。5.4 喹诺酮类药物标准物质，中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量见表 1，各组分纯度99%。表1 喹诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量 序号 中文名称 英文名称 CAS 登录号 分子式 相对分子量 1 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H19F2N3O3 351.35 2 培氟沙星 Pefloxacin 70458-92-3 C17H20FN3O3 333.36 3 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.37 4 诺氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.33 5 恩诺沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.16 6 环丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.13 注1：或等同可溯源物质。5.5 喹诺酮类药物混合标准物质标准溶液：分别精确称取洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星标准物质(5.4)各 0.010g，加入甲酸 2.0mL，用甲醇溶解，定容到 100mL，配成 100g/mL 的标准混合储备溶液，于-18保存，有效期 12 个月；移取适量标准储备溶液，用甲醇稀释成20ng/mL 中间浓度标准液，于 4保存，有效期 3 个月；使用时，用甲醇稀释中间浓度标准液，配成适当浓度的标准使用溶液，现配先用。5.6 喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂条：密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温（205），即开即用。若试剂条需要验证时，具体方法和性能指标见附录 A。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。5.7 除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。6 仪器和设备 6.1 电子天平：感量 0.01 g 和 0.001g。6.2 均质机：转速8000 r/min。6.3 离心机：转速4 000 r/min。6.4 氮气或空气吹干仪：加热温度75。6.5 微量移液器：10 L100 L，100 L1 000L。全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 3 6.6 高压灭菌锅。6.7 胶体金读卡仪（必要时）7 测定步骤 7.1 抽样 按照GB/T 30891 要求进行抽样，参考附录表B.1填写采样信息记录。7.2 试样制备 按照GB/T 30891-2014附录B规定进行各类水产品制样，将样品分割成不大于0.5 cm 0.5 cm 0.5 cm的小块后混合，用均质后制成试样。将试样分成检样和备样两份，并做标记，每份不少于20g；检样立即测试或-18以下冷冻待测，备样-18以下冷冻保藏，有效期不超过3个月。7.3 提取和净化 称取2.00 g均质后的样品于5mL离心管中，加入3mL乙腈（5.1），剧烈振荡3min，室温下，于4 000r/min离心5min；移取2 mL上清液于5 mL离心管中，在75 下用氮气或空气吹干；依次加入0.3mL正己烷（5.2）和0.3mL PBST缓冲液（5.3），加盖，上下缓慢颠倒20次；静置分层后，吸取下层溶液待测。7.4 测定 喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂条（5.5），恢复室温后，从包装袋中取出，置于水平台面上。吸取7.3中待测液的下层溶液100 L，加至喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂条的加样孔中，在3 min5 min内读取检测结果。7.5 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和阴性、阳性对照质控试验。7.5.1 空白试验 每批样品需做一孔空白对照，以PBST缓冲液（5.3）代替试样提取液，按7.4进行。7.5.2 阴性对照 称取空白样品，按7.3和7.4进行。7.5.3 阳性对照 在空白样品加入一定量喹诺酮类药物混合标准溶液（其含量检测限），按7.3和7.4进行。8 结果判断及表述 8.1 试剂条有效性判定 8.1.1 有效检测试剂条：空白对照控制线（C 线）和检测线（T 线）均出现红色条带，而且 T 线颜色达到或深于 C 线（如图 2-1），则检测试剂条有效，可进行检测；全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 4 8.1.2 失效检测试剂条：空白对照控制线（C 线）不出现红色条带（如图 2-3），则检测试剂条失效，不能进行检测。8.2 结果和表述 8.2.1 阴性 试样检测线（T 线）出现红色条带，且颜色达到或深于控制线（C 线）（如图 2-1）为阴性。结果表述：阴性（喹诺酮类药物残留量检测限）。8.2.2 阳性 试样检测线（T 线）出现红色条带，但颜色浅于控制线（C 线）或检测线（T 线）未出现红色条带（如图 2-2），为阳性。结果表述：阳性（喹诺酮类药物残留量检测限）。图 2-1 图 2-2 图 2-3 8.3 试剂条验证 试剂条性能验证参照附录A.1执行。8.4 试验质控要求 操作人员需经过专业培训，具备一定的相关工作经验。宜选用按8.3进行验证，结果符合附录A.2中各项性能指标的试剂条，按照说明书要求规范操作。同检测批不低于20%比例的平行样和2个阴性控制样品测定，同时加做2个的阳性质控样(5倍检测限和检测限各一个)，进行阴性和阳性对照质控试验；当平行样的检测结果完全一致，且阴性控制样品和阳性质控样的结果准确时，判定该批检测数据有效。8.5 试验报告 参照附录表B.2记录试验结果。9 结果复检确证 若初检结果为阳性，需要按照7、8重新检测；重复检测结果仍为阳性，需要采用参比方法确认。参比标准为农业部1077号公告-1-2008 水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法。当结果判定为阳性时，以参比标准方法确证结果为最终报告值，参照附录表B.3填写。若有必要时，阴性结果样品也可采用参比标准方法确认。全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 5 附录 A（规范性附录）试剂条验证方法和性能指标要求 A.1 验证方法 空白和添加检测限浓度的验证样品分别不少于20个，可以选择低脂鱼、高脂鱼、龟鳖、虾蟹、贝类等至少5种水产品基质。参照试剂条说明书操作，测定出现的每个组分的假阴/阳性样品数量，按表A.1计算其灵敏度、假阳性率、假阴性率、特异性和准确率。表 A.1 快速检测方法性能指标计算方法 样品情况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或 N.1+N.2 显著性差异（2）2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1 灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性 相对准确度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：1、a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。2、b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。3、N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2 表示所有的第二列；N12 表示第一行，第二列。4、C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。A.2 性能指标要求 A.2.1 检测限：诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、恩诺沙星均2 g/kg 或符合产品说明书中描述。A.2.2 灵敏度：灵敏度应95%全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 6 A.2.3 特异性：特异性应90%。A.2.4 假阴性率：假阴性率应5%。A.2.5 假阳性率：假阳性率应10%。A.2.6 相对准确率：相对准确率应95%。全国团体标准信息平台T/ZNZ 029-2020 7 附录 B（规范性附录）水产品快速检测记录表格 水产品快速检测抽样、结果报告、复检结果等记录格式见表 B.1、B.2 和 B.3。表 B.1 水产品快速检测抽样单 抽样时间：年 月 日 编号：样品名称 样品编号 受检单位 抽样地点 抽样数量 检测项目 抽样费用 受检单位对所填内容和采/抽样品有效性确认：以 上 所 填 内 容 和 采/抽 样 品 真 实 有 效。对所填内容和采/抽样品有效性有异议：负责人（签字）：（公章）年 月 日 采/抽样人员 行 政 主 管 人 员 （签字）联系电话：年 月 日 抽 样 技 术 人 员 （签字）联系电话：年 月 日 备 注 注 1、本工作单由受检单位协助采/抽样人员如实填写。2、受检单位负责人、行政人员和采样技术人