TZACA 031-2020 食源性致病菌快速检测 微流控芯片法.pdf

ICS 07.100.30CCS C53T/ZACA团体标准T/ZACA 0312020食源性致病菌快速检测微流控芯片法Rapid detection of pathogens in food Microfluidic chip method2020-10-14 发布2020-10-16 实施浙江省质量合格评定协会发 布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/ZACA 0312020I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.25仪器与设备.26试剂与材料.27检测程序.48操作步骤.49质量控制.610结果表述.611生物安全措施.6附录 A（规范性附录）微流控芯片试剂组分和存放条件.7附录 B（规范性附录）培养基及试剂.9附录 C（规范性附录）微流控芯片制作与质量控制.10全国团体标准信息平台T/ZACA 0312020II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由浙江省质量合格评定协会提出并归口。本文件主要起草单位：绿城农科检测技术有限公司、宁波爱基因科技有限公司、浙江省农业科学院。本文件主要起草人：王珍、卢先东、肖英平、刘艳红、牟文秀、陆雯、吴岳琴、周婷婷、汪腊云、刘萌、乙丛敏、张彩燕、孙莹巧、陈涛、俞琦娅、李秀通、彭醒醒。本标准为首次发布。全国团体标准信息平台T/ZACA 03120201食源性致病菌快速检测 微流控芯片法1范围本文件规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠埃希氏菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、志贺氏菌(Shigella)、阪崎肠杆菌(Cronobacter)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的快速检测方法（微流控芯片法）。本文件适用于食品中上述8种食源性致病菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 4789.1食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则GB 4789.4食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB 4789.5食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验GB 4789.7食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验GB 4789.10食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB 4789.14食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验GB 4789.30食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB 4789.36食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验GB 4789.40食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验GB 19489实验室 生物安全通用要求GB/T 27403实验室质量控制规范 食品分子生物学检测GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1微流控芯片microfluidic chip利用微加工技术，在硅、石英玻璃或高分子材料等基质上加工出各种结构，如管道、反应池、微泵、微阀等功能单元，包含1-32个靶点，检测体积5 L，30分钟完成检测，可避免气溶胶产生，是一种用于样品检测的微系统。4原理全国团体标准信息平台T/ZACA 03120202食源性致病菌待测样本经增菌（菌悬液无需增菌）提取核酸，注入预先包埋特异性基因片段引物并带有实时荧光检测的微流控芯片中，进行恒温扩增，通过微流控芯片检测仪实时捕获SYBR Green荧光信号，扩增产物随荧光信号出现的时间、强度和位置，判断样本中是否含有目标菌。5仪器与设备冰箱：2 5、-20 5；培养箱：36 1，30 1；均质器；漩涡振荡仪；电子天平：感量0.1 g；高速离心机：12 000 g/min；干式恒温仪：100 1；生物安全柜；微量点样仪；微流控芯片检测仪；核酸蛋白分析仪；微量移液器：0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L。6试剂与材料6.1适用型核酸提取试剂盒试剂组分见附录A中A.1。6.2适用型核酸检测试剂盒（微流控芯片法）微流控芯片检测试剂盒组分和存放条件见附录A中表A.2，引物混合物组分见附录A中表A.3，引物序列见附录A中表A.4。6.3微流控芯片法适用型增菌培养基成分和配制方法见附录B中B.1。6.4生理盐水配制方法见附录B中B.2。6.5质控菌株对于从标准菌种保藏中心或其他有效认证的商业机构获得原包装的质控菌株，复苏和使用应按照制造商提供的使用说明进行。阳性质控菌株见表1或等效菌株。表 1阳性质控菌株序号1菌株名称鼠伤寒沙门氏菌拉丁文Salmonella typhimurium编号CMCC(B)501152福氏志贺氏菌Shigella flexneriCMCC(B)51572全国团体标准信息平台T/ZACA 031202033副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticusATCC 178024金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 65385蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC(B)633016单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenesATCC 191157大肠埃希氏菌 O157:H7Escherichia coliO157:H7CICC 215308阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakiiATCC 295446.6微流控芯片结构及排布示意图，见图 1。图 1微流控芯片结构示意图标引序号说明：注1：132 反应孔：8个反应孔为一组，每个反应孔预包埋相应致病菌检测引物混合液，为核酸扩增反应提供合适的空间，用于检测对应致病菌，每组根据检测需要对其中1孔或多孔包埋相应致病菌的检测引物。注2：A-D 进样口7检测程序全国团体标准信息平台T/ZACA 03120204食品中常规致病菌的快速检测程序，见图2。图 2微流控芯片法检测流程8操作步骤8.1样品制备、增菌培养8.1.1方法一当检测单一目标菌时，按照GB 4789.4、GB 4789.5、GB 4789.7、GB 4789.10、GB 4789.14、GB 4789.30、GB 4789.36、GB 4789.40的方法分别对沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157和阪崎肠杆菌的样品进行制备和增菌。8.1.2方法二当需要同时检测多个病原菌时，无菌操作固体样品称取25 g，液体样品吸取25 mL样品，置于盛有225 mL相应致病菌增菌培养基的无菌均质杯或合适容器内，以8000 g/min10000 g/min均质1 min2min，或置于盛有225 mL 相应致病菌增菌培养基的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。全国团体标准信息平台T/ZACA 03120205若样品为液态，需振荡混匀。pH超出范围时，用1 mol/L无菌NaOH溶液或HCl溶液调pH至7.20.4，于36 1 培养8 h18 h。8.1.3方法三将菌株制成菌悬液直接提取核酸，核酸浓度为10 g/mL100 g/mL。8.2核酸提取取1 mL培养液或菌悬液加入1.5 mL无菌离心管中，8000 g/min离心5 min，尽量吸弃上清液，加入200 L核酸提取液和0.2 g玻璃珠（500 m 600 m），剧烈振荡混匀5 min10 min，干式恒温仪100 加热5 min，12000 g/min离心2 min，转移上清液至新离心管中。（如不能及时检测，可将上清液放置于-20 保存）。也可以采用商品化的核酸提取试剂盒提取DNA。8.3恒温扩增8.3.1试剂准备从-20 5 取出试剂盒，将各试剂于室温下解冻，充分混匀并瞬时离心后备用。取n个（n=待检测样本数）1.5 mL离心管，按照表2体系，每管加入24 L荧光等温扩增预混液和36 L已提取的检测样品DNA模板，旋涡振荡混匀并瞬时离心，总体积为60 L，见恒温扩增点样体系表2。表 2恒温扩增点样体系表（总体系 60 L）组分体积荧光等温扩增预混液24 L检测样品 DNA 模板36 L注：引物等已经预先固定到微流控芯片上，最终微流控芯片中的反应体系包含反应所需的引物。8.3.2微流控芯片加样将上述混合液用微量移液器加入到检测芯片上的对应加样孔中（每个加样孔上样体积为60 L），用芯片封口膜封住加样孔及透气孔，使用刮片赶走气泡，确保封口膜完全贴合。8.3.3扩增程序本方法采用的是恒温扩增，整个反应过程在恒温条件下完成，具体反应设置如表3：表 3恒温扩增反应条件温度反应时间荧光采集63.5 30 min每分钟采集一次注：每分钟一次的荧光采集，为了保证实时荧光检测的结果能够有效、及时的显示。8.4微流控芯片结果判断在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一个反应孔或者多个反应孔中有标准的S型的扩增曲线且Ct值30，则该反应孔对应检测判断为阳性，即该样本中含有对应检测项目的核酸；没有扩增曲线或Ct值=0的反应孔判断为阴性，即该样本不含有对应检测项目的核酸。全国团体标准信息平台T/ZACA 031202068.5实验对照检测过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照以灭菌水替代DNA模板；阴性对照为非目标菌DNA提取物或试剂盒内的阴性对照；阳性对照为目标菌DNA模板。9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：空白对照：反应时间30 min内，无荧光信号检出，未出现典型扩增曲线；阴性对照：反应时间30 min内，无荧光信号检出，未出现典型扩增曲线；阳性对照：反应时间30 min内，有荧光信号检出，且出现典型扩增曲线Ct值30。10结果表述10.1结果为阴性，表述为“未检出 XXX 核酸”。10.2结果为阳性，表述为“XXX 初筛阳性”，阳性样本按 GB 4789.进行确证并报告结果。11生物安全措施11.1实验室设备、设施要求及废弃物处理应符合 GB 19489 的规定。11.2微流控芯片的检测工作应由具备生物实验操作经验人员承担。11.3检验过程中防止交叉污染的措施应按照 GB/T 27403 的规定执行。全国团体标准信息平台T/ZACA 03120207AA附录A（规范性附录）微流控芯片试剂组分和存放条件A.1适用型核酸提取试剂盒与微流控芯片检测试剂盒组分和存放条件表 A.1适用型核酸提取试剂盒组分和存放条件序号名称存放条件备注1核酸释放剂4 含盐酸胍，尿素等2玻璃珠室温（500 m600 m）表 A.2微流控芯片检测试剂盒组分和存放条件序号名称存放条件备注1荧光等温扩增预混液-20 含 Bst 酶，dNTPs，SYTO-9，SYBR Green 荧光染料等2阳性对照-20 上述致病菌人工合成的靶基因片段溶液3阴性对照-20 灭菌去离子水4检测芯片-20 已固定检测引物，检测通量 1-32 个靶点，反应体积 5 LA.2微流控芯片恒温扩增所使用引物混合固定体系与引物序列表 A.3微流控芯片的引物混合固定体系（1.5 L）组分体积（引物浓度为 100 M）F3(Forward Outer Primer)上游外部引物0.01 LB3(Backward Outer Primer)下游外部引物0.01 LFIP(Forward Inner