TSHRH 023-2019 化妆品屏障功效测试 体外重组 3D表皮模型测试方法.pdf

ICS 71.100.70 C2682 Y42 团团 体体 标标 准准 T/SHRH 023-2019 _ 化妆品屏障功效测试 体外重组 3D 表皮模型 测试方法 Skin barrier efficacy test of cosmetics-In vitro reconstructed human skin test method 2019-12-30 发布 2020-01-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH 全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 1 目目 次次 前言 2 1 范围 3 2.规范性引用文件 3 3.术语、定义 3 4.试验原则 3 5.试剂及仪器设备 3 6.试验步骤 4 7.结果计算 5 8.质量控制 5 9.结果判定 6 附录 A：资料性附录 7 全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 2 前前 言言 本标准按照 GB/T1.1-2009 给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准起草单位：广东博溪生物科技有限公司、上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准主要起草人：李潇、张艳云、韩波、曹平、陈田、陈静、聂菁、曾四立、吴梅芳、陈贞明、谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、李琼、金坚、陈亦华。全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 3 化妆品屏障功效测试化妆品屏障功效测试 体外重组体外重组 3D 表皮模型测试方法表皮模型测试方法 1 范围范围 本标准规定了一种基于体外重组 3D 表皮模型的化妆品原料及成品的屏障功效测试方法。本标准可作为化妆品屏障功效测试替代方法之一，也可结合其他方法对化妆品屏障功效进行评价。本标准适用于具有屏障提升作用的化妆品原料及驻留型化妆品成品的屏障功效性测试，不适用于洗去型化妆品。2 规范性规范性引用文件引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27830-2011 化学品 体外皮肤腐蚀 人体皮肤模型试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语、定义术语、定义 3.1 细胞活性 cell viability 测定细胞群体总活力的指标 如细胞线粒体脱氢酶还原活性染料噻唑蓝（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，MTT）的能力，指标的测定取决于试验终点和所用的设计方案，并与细胞总数和活性细胞数量有关。3.2 半数有效时间 median effective time，ET50 待测物在固定浓度下导致细胞存活率降低 50所需的暴露时间。3.3 吸光度 optical density,OD 入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。4 试验原则试验原则 4.1 本标准使用的体外重组 3D 表皮模型（EpiKutis），具有表皮的复层化结构（基底层、棘层、颗粒层和角质层）和屏障功能。刺激物十二烷基硫酸钠（SLS）接触模型，造成皮肤屏障与模型组织的损伤。4.2 屏障提升功效是通过一系列的物理、生物化学的作用，提升皮肤活细胞层与角质层的结构功能，达到提升皮肤屏障功能的作用。ET50值表征皮肤耐受外源刺激物的能力，以此评价待测物对皮肤屏障的提升作用。5 试剂及仪器设备试剂及仪器设备 5.1 试剂和材料试剂和材料 5.1.1 体外重组 3D 表皮模型（EpiKutis）。全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 4 5.1.2 体外重组 3D 表皮模型培养液（EpiGrowth 培养液）。5.1.3 磷酸盐缓冲液（PBS）。5.1.4 Triton X-100(1%，V/V)。5.1.5 MTT（CAS No.298-93-1）。5.1.6 异丙醇。5.1.7 阴性对照：十二烷基硫酸钠（0.2%SLS）。5.1.8 阳性对照：WY14643（PPAR 激活剂）。5.2 仪器和设备仪器和设备 5.2.1 移液器：M25 活塞排代式移液器及相应吸头，20L200L、100L1000L 移液器及相应吸头。5.2.2 CO2培养箱：37 1，（51）%CO2，95%相对湿度。5.2.3 酶标仪：570nm。5.2.4 超净工作台。5.2.5 水平振荡仪。5.2.6 分析天平（精度 0.1mg）。6 试验步骤试验步骤 6.1 对照设置 试验需设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物组，每组 9 个模型。（ET50测定中设置了 3 个时间点，每个时间点 3 个模型重复，总计 9 个模型）。6.2 测试准备 阴性对照与阳性对照的工作液按照附录 A 配制。6.3 待测物预处理 吸取 200L SLS 溶液（0.4%）和 200 L 待测物置于 1.5mL 离心管中，旋涡混匀。6.4 模型准备 根据试验组别及模型数量，准备 6 孔板，并在相应孔中添加 0.9mL 的 EpiGrowth 培养液。6.5 给药 化妆品成品给药方式 对阴性对照组和阳性对照组，吸取 25L SLS 溶液（0.2%）涂抹于模型表面。对待测物组，吸取25L 预处理后的溶液涂抹于模型表面。对阳性对照组，需在 EpiGrowth 培养液中添加 50M WY14643。空白对照组不进行给药处理。给药结束后，将 6 孔板转移到 CO2培养箱中孵育 24h（37 1、5 1%CO2、95%相对湿度）。化妆品原料给药方式 对阴性对照组、阳性对照组和待测物组，吸取 25L SLS 溶液（0.2%）涂抹于模型表面。对待测物组，需在 EpiGrowth 培养液中添加相应浓度的待测物。对阳性对照组，需在 EpiGrowth 培养液中添加 50M WY14643。空白对照组不进行给药处理。给药结束后，将 6 孔板转移到 CO2培养箱中孵育 24h（37 1、5 1%CO2、95%相对湿度）。6.6 清洗 全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 5 模型孵育培养结束后，开始清洗程序。用无菌 PBS 溶液重复清洗模型表面 10 次，去除残留的待测物。用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体，放入新标记的 6 孔板中，并在每孔中加入 0.9mL EpiGrowth 培养液，用于 ET50测定。6.7 ET50测定：各组模型表面滴加 80L 1%TritonX-100，孵育时间设定为 0h，1h，3h，其中孵育时间设置为 0h的模型，不进行给药。模型孵育结束后，开始清洗程序。用无菌 PBS 溶液重复清洗模型表面 10 次，去除残留的TritonX-100。每个模型的清洗总时间控制在 12 min。根据模型总数量准备 24 孔板，并向每孔加入 0.3mL 的 MTT 工作液。将模型转移至 24 孔板中，置于 CO2培养箱中（37 1、5 1%CO2、95%相对湿度），孵育 3h 5min。MTT 反应结束后，用移液器吸弃 MTT 溶液，加入 300L PBS 溶液，清洗模型外表面，重复此清洗过程 3 次。将模型外表面用无菌棉签擦干，转移到新的 24 孔板中，在模型内加入 2mL 异丙醇。用封口膜密封 24 孔板，于 4静置过夜或在水平震荡器上常温震摇 2h。从每孔中吸取 2 份 200L 异丙醇浸提液，加入 96 孔板的对应孔中，做好标记。采用异丙醇作为调零对照，酶标仪 570nm 波长读取吸光度（OD）值。7 结果结果计算计算 7.1 ET50计算 7.1.1 阳性对照组：阳性对照组各时间点组织活力=（阳性对照组各时间点 OD 值-调零对照 OD 值）/（阳性对照 0h OD 值-调零对照 OD 值）*100%。7.1.2 阴性对照组：阴性对照组各时间点组织活力=（阴性对照组各时间点 OD 值-调零对照 OD 值）/（阴性对照 0h OD 值-调零对照 OD 值）*100%。7.1.3 空白对照组：空白对照组各时间点组织活力=（空白对照组各时间点 OD 值-调零对照 OD 值）/（空白对照 0h OD 值-调零对照 OD 值）*100%。7.1.4 待测物组：待测物组各时间点组织活力=（待测物组各时间点 OD 值-调零对照 OD 值）/（待测物组 0h OD 值-调零对照 OD 值）*100%。7.1.5 ET50值计算 以各组组织活力邻近 50%左右的两个时间点为横坐标，其对应组织活力为纵坐标，绘制折线图，计算线性回归方程。根据公式，计算组织活力为 50%时，对应的时间，即为该组的 ET50值。8 质量控制质量控制 8.1 基本原则：每批次试验均需设置空白对照、阴性对照和阳性对照。试验中设置的各种对照应符合以下标准。如任一种对照出现非下述标准，则视为质控不合格。8.2 阴性对照组：与空白对照组相比，模型组织活力（0h）下调 15%以上。同一孵育时间下三个重复模型组织活力标准偏差均小于等于 18%。8.3 阳性对照组：与阴性对照组相比，模型组织活力（0h）上调 15%以上。同一孵育时间下三个重复模型组织活力标准偏差均小于等于 18%。全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 6 8.4 待测物组：同一孵育时间下三个重复模型组织活力标准偏差均小于等于 18%。9 结果判定结果判定 以下条件说明待测物具有屏障提升功效:与阴性对照组相比，待测物 0h OD 值上调，且有统计学显著性差异；与阴性对照组相比，待测物 ET50值升高；如待测物满足上述部分条件，仍可说明待测物具有屏障提升功效。全国团体标准信息平台T/SHRH 023-2019 7 附录 A（资料性附录）1.阴性对照组母液的配制 用分析天平称取 0.2g SLS，溶于 5mL PBS，配制成 4%SLS 母液，使用前需用 0.22m 滤膜过滤。2.阴性对照组工作液配制 用移液器吸取 25L 4%SLS 母液，溶于 475L PBS，配制成 0.2%的 SLS 工作液，备用。3.阳性对照母液的配制 用分析天平称取 10mg WY14643（分子量 323.8），溶于 1mL DMSO 溶液，配制成浓度为 30.88mM的 WY14643 母液。4.阳性对照工作液的配制 吸取 16.5L WY14643 母液，溶于 10mL EpiGrowth 培养液中，配制成 50 M WY14643 工作液，备用。5.1%TritonX-100 溶液配置 使用排代式移液器，吸取 100L TritonX-100，加入 9900L PBS 溶液，混匀分装后，4冰箱保存备用。_ 全国团体标准信息平台