TNAIA 0121-2022 枸杞中枸杞多糖含量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 65.020.01B 38TB团团体体标标准准T/NAIA 0121-2022枸杞中枸杞多糖枸杞中枸杞多糖含量的测定含量的测定高效液相色谱法高效液相色谱法Determination of polysacaride content in WolfberryHigh performance liquchid chromatograpHy2022-07-01发布2022-07-15 实施宁夏化学分析测试协会宁夏化学分析测试协会发发 布布全国团体标准信息平台I前 言本文件按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则规定编写。本文件由宁夏回族自治区药品检验研究院（国家枸杞产品质量检验检测中心（宁夏）提出。本文件由宁夏化学分析测试协会归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区药品检验研究院（国家枸杞产品质量检验检测中心（宁夏）、宁夏医科大学、宁夏沃福百瑞枸杞产业股份有限公司、宁夏中宁枸杞产业创新研究院有限公司。本文件主要起草人：马玲、马学琴、陈欢、杨玲玲、尚博杨、郭荣、马宗卫、余君伟、苏晓娟、刘淑瑛、臧娅妮、王迎利、徐波、李艳婷、赵小军、赵茜、任如如、撖志明、雷艳、梁建宁。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台1枸杞中枸杞多糖含量的测定高效液相色谱法1 范围本文件规定了枸杞子及其制品中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖含量的高效液相色谱测定方法。本文件适用于枸杞子及其制品中上述 10 种多糖类物质单个或多个成分含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理试样中的枸杞多糖先用乙醚和80%的乙醇脱脂和脱色素，经热水提取后用无水乙醇沉淀多糖，醇沉多糖用水溶解后，用4 mol/L三氟乙酸溶液水解为单糖，再加0.5 mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化，溶液用微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定，内标法定量。5 试剂与材料除另有说明外，在分析中使用分析纯试剂和 GB/T 6682中规定的一级水。5.1 甲醇：色谱纯。5.2 乙腈：色谱纯。5.3 磷酸二氢钾。5.4 氢氧化钠。5.5 无水乙醇。5.6 乙醚。5.7 甲苯。5.8 盐酸。5.9 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）。全国团体标准信息平台25.10 三氟乙酸。5.11 pH6.5磷酸盐缓冲液：取0.8 g氢氧化钠，用水溶解并稀释至200 mL，即得0.1 mol/L氢氧化钠溶液；称取6.8 g 磷酸二氢钾，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液152 ml，用水稀释至1000ml，即得pH6.5磷酸盐缓冲液。5.12 80%乙醇溶液：取400 mL无水乙醇，加水稀释至500 mL，即得。5.13 4 mol/L三氟乙酸溶液：准确量取29.7 mL三氟乙酸于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得。5.14 4 mol/L氢氧化钠溶液：取16 g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100 mL，即得。5.15 0.4 mol/L氢氧化钠溶液：取4 mol/L的氢氧化钠溶液10 mL，加水稀释至100 mL，即得。5.16 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液：精密称取PMP 0.87 g，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。5.17 0.4 mol/L盐酸溶液：取0.36 mL盐酸加水稀释至10 mL，即得。5.18 标准品：D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖糖醛酸、D-一水合半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖、2-脱氧-D-核糖等物质的CAS号及纯度见附录A。5.19内标使用溶液精密称取2-脱氧-D-核糖标准品适量（精确至0.00001g），用水溶解并配制成质量浓度为1.3mg/mL的溶液，作为内标使用溶液。5.20单标储备溶液分别准确称取经真空干燥至恒重的甘露糖、岩藻糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖适量（精确至0.00001g），用水溶解并配制成质量浓度为10mg/mL 的单标储备溶液，贮存于密闭容量瓶中避光于4下储存。5.21混合标准储备溶液分别精密量取（5.20）项下的单标储备溶液适量，用水溶解并稀释制成含甘露糖50 g/mL、岩藻糖30 g/mL、核糖20 g/mL，鼠李糖70 g/mL、葡萄糖醛酸70 g/mL、木糖140 g/mL、半乳糖醛酸440 g/mL、半乳糖400 g/mL、阿拉伯糖330 g/mL、葡萄糖500 g/mL的溶液，作为混合标准储备溶液。5.22微孔滤膜0.45 m，有机相。6 仪器与设备6.1高效液相色谱仪（配紫外检测器）6.2 分析天平，感量 0.00001g。6.3 旋转蒸发仪。6.4 离心机。6.5 超纯水机。全国团体标准信息平台36.6 粉碎机。6.7 真空干燥箱。7 试样制备7.1样品制备取-18冷冻冰箱中保存的枸杞子样品，粉碎，置于干燥器中在-18冰箱保存，待用。7.2脱脂脱色准确称取枸杞粗粉2g（精确至0.00001g）至锥形瓶中，加乙醚200 mL，加热回流2 h，静置，放冷，小心弃去乙醚液，残渣置水浴上挥尽乙醚，再加入80%乙醇200 mL，加热回流 2 h，趁热滤过，用80%热乙醇50 mL分次洗涤滤渣和滤器，待用。7.3水提醇沉取滤渣连同滤纸置锥形瓶中，加水200 mL，加热回流3 h，趁热过滤，用少量热水洗涤滤器，合并滤液和洗液，置旋转蒸发仪上浓缩至约5 mL，用水15 mL转移至离心瓶中，加无水乙醇80 mL充分混匀，4 静置12 h，以4000 r/min离心10 min，弃去上清液，得醇沉物。7.4水解将醇沉物溶解在热水（70-80）中并定量转移至10 mL容量瓶中，冷却至室温，用水稀释至刻度，并充分混合，转移至离心管中，以4000 r/min离心10 min。精密量取上清液2 mL，置5 mL量瓶中，加入4 mol/L三氟乙酸溶液1 mL，100 水解3 h，冷却至室温，加入4 mol/L氢氧化钠溶液1mL，用水定容至刻度，摇匀，待衍生化。7.5衍生化精密吸取（7.4）项下溶液1 mL，置样品瓶中，加入内标使用溶液0.1 mL，加0.4 mol/L氢氧化钠溶液0.5 mL，加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液1mL，80 加热60 min，冰水浴中放置10 min，加入0.4mol/L盐酸溶液0.5 mL中和，混匀，转移至离心管中，加入甲苯4 mL，充分振摇后，4000 r/min离心10 min，取下层溶液，用0.45 m的滤膜（5.22）过滤，取续滤液上机测定。8 分析步骤8.1高效液相色谱参考条件色谱柱：C18 柱，长250 mm，内径4.6 mm，粒度3.5 m，或性能相当者。流动相：乙腈-pH6.5磷酸盐缓冲液（16:84）。柱温：30。检测波长：250 nm。进样体积：20 L。流速：按表1进行洗脱。全国团体标准信息平台4表 1程序洗脱表时间（min）流速（mL/min）01.0131.0180.7800.7851.01301.08.2标准曲线的制作分别精密量取（5.21）项下的混合标准储备溶液0.05 mL、0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL，置样品瓶中，分别加水使成1 mL，加入内标使用溶液0.1 mL，加0.4 mol/L氢氧化钠溶液0.5mL，加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液1mL，80加热60 min后，冰水浴中放置10 min，加入0.4 mol/L盐酸溶液0.5 mL中和，混匀，转移至离心管中，加入甲苯4 mL，充分振摇后，4000 r/min离心10 min，取下层溶液，用0.45 m的滤膜（5.22）过滤，即得系列线性测定混合标准使用溶液。取上述系列溶液按（8.1）项下的方法测定，记录峰面积，以各单糖标准品与内标的峰面积比值X为横坐标，以各单糖标准品与内标的质量比值Y为纵坐标，计算标准曲线或求线性回归方程。8.3测定步骤取平行两份的枸杞子试样溶液测定，枸杞子试样中各单糖的响应值应在标准曲线范围内。以内标法计算单糖含量。同时做空白试验。单糖混合标准品溶液及枸杞子试样溶液色谱图参见附录B。8.4方法的检测限和定量限本文件方法的检测限、定量限见附录 C。9 结果计算试样中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖的含量以质量分数i计，数值以毫克每克（mg/g）计，按式（1）计算：=1 252（1）式（1）中：由标准曲线得出的试样中某种单糖（甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖）与内标（2-脱氧-D-核糖）的质量比m1内标的质量，单位为毫克（mg）；m2试样的质量，单位为克（g）；25稀释倍数。全国团体标准信息平台5试样中枸杞多糖的含量是甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖的含量之和，以质量分数计，数值以毫克每克（mg/g）计，按式（2）计算：=110?（2）测定结果保留三位有效数字。10 精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的5%。全国团体标准信息平台6附 录 A（规范性附录）11种标准品中文名称、CAS号和纯度11种标准品中文名称、CAS号和纯度见表A.1。表A.111种标准品中文名称、CAS号和纯度序号名称CAS号纯度1D-甘露糖3458-28-4100.0%2D-核糖50-69-199.0%3L-鼠李糖10030-85-099.0%4D-葡糖糖醛酸6556-12-398.0%5D-一水合半乳糖醛酸91510-62-297.0%6D-葡萄糖50-99-7100.0%7D-半乳糖59-23-499.0%8D-木糖58-86-699.0%9D-阿拉伯糖10323-20-399.0%10L-岩藻糖2438-80-499.0%112-脱氧-D-核糖（内标）50-69-198.0%全国团体标准信息平台7附 录 B（资料性附录）单糖混合标准品溶液及枸杞子试样溶液色谱图单糖混合标准品溶液及枸杞子试样溶液色谱图见图B.1和图B.2。图B.1 10种单糖混合标准使用溶液色谱图图B.2枸杞子试样溶液色谱图标引序号说明：1-甘露糖；2-核糖；3-鼠李糖；4-葡萄糖醛酸；5-半乳糖醛酸；6-葡萄糖；7-半乳糖；8-木糖；9-阿拉伯糖；10-岩藻糖；11-2-脱氧-D-核糖（内标）全国团体标准信息平台8附 录 C（规范性附录）方法检测限和定量限方法的检测限和定量限见表C.1。表C.1方法检测限和定量限标样名称定量限（g/mL）检测限（g/mL）甘露糖0.382260.12742核糖0.299170.08975鼠李糖0.385360.12845葡萄糖醛酸1.322430.66122半乳糖醛酸0.554500.18483葡萄糖0.267890.08037半乳糖0.127210.03816木糖0.213580.08543阿拉伯糖0.106000.04240岩藻糖0.428570.12857全国团体标准信息平台