TSDAA 0054-2021 动物性食品中12种β-受体激动剂类药物检测技术规范 酶联免疫吸附法.pdf

ICSICS 65.020.3065.020.30B B 4545团团体体标标 准准T/SDAAT/SDAA 005400542022021 1动物性食品中动物性食品中 1212 种种-受体激动剂类药受体激动剂类药物物检测技术规范检测技术规范 酶联免疫吸附酶联免疫吸附法法Technicol code of 12 kinds-agonists residues in animalderived food Enzyme-linked immunosorbent assay2021202112121313 发布发布202220221 11414 实施实施山东省畜牧协会发布发布全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 1全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 1前前 言言本文件按照 GB/T1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则中的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧协会提出并归口。本文件起草单位：青岛市农产品质量安全中心、北京维德维康生物技术有限公司、诸城百尺河畜牧兽医站、诸城皇华畜牧兽医站。本文件主要起草人：李辉、邱增枝、初晓娜、穆阿丽、吴燕、崔莉、刘倩、庄桂玉、王海波、张朋朋、于新海、崔志伟、王海森、邢维维。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 1全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 1动物性食品中动物性食品中 1212 种种-受体激动剂类药物受体激动剂类药物检测技术规范检测技术规范酶联免疫吸附酶联免疫吸附法法1范围本文件规定了酶联免疫吸附法（ELISA）检测动物性食品中12种-受体激动剂类药物残留量的技术规范。本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉中克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙那林、特布他林、妥布特罗、溴布特罗、马喷特罗、西布特罗、马布特罗、班布特罗、西马特罗和非诺特罗等 12 种-受体激动剂类药物总残留量的测定。本文件方法的最低检测限：猪肉、牛肉、羊肉中 12 种-受体激动剂类药物总残留量的最低检测限均为 1g/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 33411酶联免疫分析试剂盒通则3原理采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上包被克伦特罗抗原，试样中残留的-受体激动剂类药物与酶标板上的克伦特罗抗原竞争克仑特罗抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度,吸光值与 12 种-受体激动剂类药物残留总量成负相关，与标准曲线比较即可得出 12 种-受体激动剂类药物残留量。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 14试剂或材料以下所用的试剂，除非另有规定外，仅使用分析纯试剂4.1水，GB/T 6682，三级。4.2氢氧化钠（NaOH）4.3三氯乙酸（C2HCl3O2）4.4氢氧化钠溶液：C(NaOH)=1 mol/L，称取氢氧化钠（4.2）40.0 g，加水溶解定容至 1000 mL。4.5三氯乙酸溶液：C(C2HCl3O2)=10 g/L，称取三氯乙酸（4.3）10.0 g，加 1000 mL 水溶解，摇匀。4.6-受体激动剂检测试剂盒28保存。4.6.1包被有克仑特罗抗原的 96 孔板规格为 12 条8 孔。4.6.2克仑特罗抗体工作液4.6.3酶标记物工作液4.6.420 倍浓缩洗涤液4.6.5底物液 A 液4.6.6底物液 B 液4.6.7终止液4.6.8克仑特罗系列标准溶液6 个浓度梯度，浓度分别为 0g/L、0.2g/L、0.6g/L、1.8g/L、5.4g/L、16.2g/L。4.6.9洗涤工作液用水将 20 倍的浓缩洗涤液按 1:19 体积比进行稀释（1 份 20 倍浓缩洗涤液+19 份水），用于酶标板的洗涤。28保存，有效期 1 个月。4.6.10底物液 A、B 混合液底物液 A 液、底物液 B 液按体积 1:1 充分混匀，混合液在 5 min 内使用，避免使用金属盛装、搅拌混合液。5仪器设备5.1酶标仪配备 450 nm 滤光片。5.2微量移液器单道 20 L200 L、200 L1000 L 微量移液器，8 道 50 L300 L 微量移液器。5.3均质器转速 10000 r/min15000 r/min。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 15.4微量振荡器适用 96 孔板。5.5旋涡混合器5.6天平感量为 0.01 g。5.7离心机转速4000 r/min。6试样制备样品保存在-20冰箱中。取新鲜或解冻的空白样品，剪碎，置于均质器中以 10000 r/min15000 r/min 高速均质 1min。7 分析步骤7.1 样品处理称取试样 2 g0.01 g 于 50 mL 离心管中，加入 4 mL 三氯乙酸溶液（4.5），充分混匀；4000 r/min离心 5 min；取 1 mL 上清液于新的离心管中，加入 30 L 氢氧化钠溶液（4.4），涡动 10 s 混匀；4000 r/min 离心 5 min；取 50 L 上清液进行检测。稀释倍数为 2 倍。7.2测定步骤使用前将试剂盒置于室温（19 25）下放置 1 h2 h。7.2.1 按每个标准溶液和试样溶液分别至少做两份平行试验计算，将所需数目的酶标板条插入板架中，记录各标准溶液和试液的位置。7.2.2加 50 L 各标准溶液（4.6.8）或试样溶液到各自微孔中。7.2.2加入 50 L 抗体工作液（4.6.2）到每一微孔中，充分混匀，室温下（252）避光反应 15 min。7.2.3 倒掉孔中液体，每孔加入 260 L 洗涤工作液（4.6.9），充分洗涤 4 次，每次浸泡 15 s30s。7.2.4 倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；立即在每孔中加入 100 L 酶标记物工作液（4.6.3），充分混匀，室温下（252）避光反应 15 min。7.2.5 重复步骤 7.2.3；7.2.6 立即在每孔中加入 100 L 底物 A、B 混合液（4.6.10），充分混匀，室温下（252）避光反应 15 min20 min。7.2.7 每孔中加入 50 L 终止液（4.6.7），充分混匀；终止后 5 min 内用酶标仪在波长 450 nm 处测定吸光度。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 17.3空白试验取试剂盒中提供的空白，按 7.2 测定步骤进行。7.4质控试验每次测定均应做 1 个用空白试样添加标准溶液的质控样品。8结果计算和表述8.1 相对吸光度值用标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）：Ar=BB0100%（1）式中：Ar相对吸光度值，%；B 标准（或试样）溶液的平均吸光度值；B0空白的平均吸光度值。计算结果保留 3 位有效数字。8.2 绘制标准曲线以相对吸光度值（%）为纵坐标，以各标准溶液浓度（g/L）的自然对数为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。每次试验均需新绘制标准曲线。8.3 样品结果计算样品中-受体激动剂类药物残留总量以 X 表示，数值以微克每千克（g/kg）表示，按式（2）计算：X=C n（2）式中：C从标准曲线上查德的试样溶液中的药物浓度，单位为微克每升（g/L）；n试样稀释倍数。计算结果保留三位有效数字。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 005400542022021 19.交叉反应克仑特罗：100%。氯丙那林：141%妥布特罗：80%溴布特罗、马喷特罗：107%西布特罗：86.9%。沙丁胺醇：60.6%。马布特罗：56.3%。特布他林：33.1%。班布特罗：18%。西马特罗：14%。非诺特罗：10.6%。10.精密度10.1灵敏度本方法在猪肉、牛肉、羊肉样品中-受体激动剂类药物残留总量的检测限均为 1 g/kg。10.2准确度本方法在 1 g/kg10g/kg 添加浓度水平上回收率均为 60%120%。10.3准确度本方法的批内变异系数20%，批间变异系数30%。全国团体标准信息平台