TSDAA 0045-2021 多杀性巴氏杆菌的检测 PCR法.pdf

ICSICS 65.020.3065.020.30B B 4343团团 体体 标标 准准T/SDAAT/SDAA 00450045202120212021202111113030 发布发布2021202112123131 实施实施山东省畜牧协会发布发布多杀性巴氏杆菌的检测PCR 法Detection of Pasteurella multocida by PCR全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0045004520212021全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0045004520212021前言本文件按照GB/T 1.12020的规定起草。本文件由山东省畜牧协会提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：青岛农业大学、青岛农业大学海都学院、山东省动物疫病预防与控制中心。本文件主要起草人：韩先杰、邱慧玲、兰邹然、陈甫、高善颂、宋春阳、张廷荣、于光辉、于忠娜。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0045004520212021全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0045004520212021多杀性巴氏杆菌的检测PCR 法1范围本文件规定了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。本方法适用于猪多杀性巴氏杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 564-2016 猪巴氏杆菌病诊断技术3原理根据多杀性巴氏杆菌的基因序列设计一对特异性引物，以多杀性巴氏杆菌的 DNA 核酸为模板，扩增特异的目的 DNA 片段。扩增的 DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳，根据 DNA 条带的大小来判断结果。4试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，一级。4.25%绵羊鲜血平板4.3革兰氏染液4.42Taq Master Mix4.5DNA Marker DL 20004.6琼脂糖4.7TAE缓冲液4.84S Green Plus 无毒核酸染料全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 00450045202120215仪器设备5.1 生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。5.2 高速冷冻离心机：转速不低于12000 rpm/min。5.3 PCR仪：最大升降温速率为4/秒，温度范围499。5.4 凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pg EB染色的双链DNA。5.5 紫外透射仪：透射紫外光源波长为 302nm。5.6 电泳仪，恒压输出范围：3300V、恒流输出范围：1400mA、恒功率输出范围：1120W。6样品按照NY/T 541 的规定采集、贮存样品。7试验步骤7.1 细菌的分离及纯培养7.1.1 在生物安全柜内，将无菌采取的患病动物心血用接种环直接在绵羊鲜血平板上划线接种。对采集的肺脏、肝脏或脾脏，用酒精灯火焰烧红的刀片烧烙肺脏、肝脏或脾脏的表面，用无菌手术剪刀在烧烙部位剪开一个小口。酒精灯火焰灼烧接种环，冷却后将接种环从病料的小口处扎入肺脏等内部，挑取少量组织，在 5%绵羊鲜血平板上划线接种。接种后的平板贴好标签后放入恒温箱，37培养 24h，观察菌落大小、形态、溶血状况等。7.1.2 猪多杀巴氏杆菌的菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑似粘液状、大小为 1mm1.5mm左右，菌落形态参见附录 A.1。7.2 革兰氏染色与镜检7.2.1 取洁净的载玻片，用接种环钩取一环无菌生理盐水在载玻片上涂布呈直径 1cm 大小的水膜。挑取单个菌落均匀涂抹在水膜内，室温干燥、火焰固定。进行革兰氏染色。7.2.2 滴加结晶紫染色液，染色 1min2min，流水缓慢冲洗，干燥；7.2.3 滴加革兰氏碘液，染色 1min2min，流水缓慢冲洗，干燥；7.2.4 滴加 95%的乙醇，脱色 10s30s，流水缓慢冲洗，干燥；全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 00450045202120217.2.5 滴加复染液，复染 1min，流水缓慢冲洗，自然干燥。7.2.6 镜检猪多杀巴氏杆菌为革兰氏染色阴性、短小杆菌或球杆菌，细菌形态参见附录 A.2。7.3PCR 检测7.3.1 细菌基因组 DNA 模板的制备按照 NY/T564-2016 中 4.4.4 中的规定制备。7.3.2 PCR 扩增7.3.2.1 引物根据多杀巴氏杆菌 16S rRNA 基因序列（见附录 A.3），设计一对引物，商业合成，引物序列见附录 B.1。7.3.2.2 PCR 反应体系PCR 反应体系为 25L 体系，见附录 B.2。7.3.2.3 PCR 反应条件样品反应管以 2000 rpm/min 离心 1min，置于 PCR 扩增仪内进行扩增。PCR 反应条件为：94预变性 5min，94变性 30 s，53退火 30s，72延伸 30s，扩增 32 个循环，72终延伸 10min，结束反应。同时设置多杀巴氏杆菌阳性（标准株）和阴性（无菌水）对照。PCR扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外透射仪或凝胶成像仪观察扩增 DNA 条带的大小。7.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳按 NY/T 564-20164.4.6 规定执行。7.5 结果判定7.5.1 试验成立的条件参照 DL2000 DNA Marker 中 DNA 条带的大小，当阳性对照扩增出约 355bp 片段，阴性对照未扩增出片段，检测结果成立，核酸电泳结果见附录 B.3。7.5.2 阳性判定符合 7.5.1 的条件下，被检样品扩增出约 355bp 的片段，则判定被检细菌为多杀性巴氏杆菌。全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 00450045202120217.5.3 阴性判定符合 7.5.1 的条件下，被检样品未扩增出约 355bp 的片段，则判定被检细菌不是多杀性巴氏杆菌。附 录 A（资料性）A.1 多杀性巴氏杆菌多杀性巴氏杆菌的的菌落菌落形态（图形态（图A A.1.1）A.2 猪猪多杀性巴氏杆菌多杀性巴氏杆菌形态（图形态（图A A.2.2）图图 A A.1 1猪多杀巴氏杆菌菌落形态（绵羊鲜血平板）猪多杀巴氏杆菌菌落形态（绵羊鲜血平板）图图 A.2A.2 猪多杀巴氏杆菌形态（革兰氏染色）猪多杀巴氏杆菌形态（革兰氏染色）全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0045004520212021A.3 靶基因片段及引物在靶基因中的位置靶基因片段及引物在靶基因中的位置（图（图A A.3.3）TAATACTTGGGAATCTGGCTTATGGAGGGGGATAACTGTGGGAAACTGCAGCTAATACCGCGTATTCTCTGAGGAGGAAAGGGTGGGACCTTAGGGCCACCTGCCATAAGATGAGCCCAAGTGGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCTGCGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGTAATGAGGAAGGGATGTTGTTAAATAGATAGCATCATTGACGTTAATTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATAACTGGGCGTAAAGGGCACGCAGGCGAACTTTTAAG图A.3设计引物的参照序列附 录 B（规范性）B.1 PCR 扩增的引物序列（表（表B B.1.1）引物名称引物序列（5-3方向）扩增片段大小上游引物（F）TATGGAGGGGGATAACTGTG355bp下游引物（R）GTCGTTAACGTCAATGATGCB.2 PCR 扩增体系（表（表B B.2.2）组 分体 积（L）2Taq Master Mix12.5上游引物1.0下游引物1.0DNA模板1.0无菌H2O9.5下游引物下游引物上游引物上游引物全国团体标准信息平台T/SDAAT/SDAA 0045004520212021B.3 PCR检测多杀巴氏杆菌核酸电泳结果（图（图B B.3.3）全国团体标准信息平台