细胞工程2培养细胞常规检查及特性鉴定.ppt

C ELL ENGINEERING 细胞工程细胞工程 第一章第一章 绪论绪论 4 4个学时个学时 第二章第二章 实验室配置及基本技术实验室配置及基本技术 2 2个学时个学时 第三章第三章 植物细胞工程的理论基础植物细胞工程的理论基础 4 4个学时个学时 第四章第四章 植物组织器官培养技术植物组织器官培养技术 6 6个学时个学时 第五章第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产植物细胞培养及次生代谢产物生产 3 3个学时个学时 第六章第六章 原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交 3 3个学时个学时 第七章第七章 人工种子及植物种质资源保存人工种子及植物种质资源保存 2 2个学时个学时 第八章第八章 胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养 2 2个学时个学时 第九章第九章 动物细胞培养动物细胞培养 4 4个学时个学时 第十章第十章 动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体 4 4个学时个学时 第十一章第十一章 动物组织与胚胎工程动物组织与胚胎工程 1 1个学时个学时 第十二章第十二章 试管动物与克隆动物试管动物与克隆动物 1 1个学时个学时 课程初步安排：课程初步安排：3636学时学时 第八章第八章 动物细胞培养动物细胞培养 第一节第一节 动物细胞体外培养方法动物细胞体外培养方法 第二节第二节 体外培养动物细胞的生物学特性体外培养动物细胞的生物学特性 第三节第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定培养细胞常规检查和特性鉴定 第四节第四节 动物细胞的低温保存动物细胞的低温保存 第五节第五节 细胞同步化细胞同步化 第六节第六节 器官培养器官培养（自学）（自学）第三节第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定培养细胞常规检查和特性鉴定 一、培养细胞常规检查一、培养细胞常规检查 （一）肉眼观察培养物颜色及混浊度（一）肉眼观察培养物颜色及混浊度 （二）倒置显微镜观察细胞生长状态（二）倒置显微镜观察细胞生长状态 （三）培养细胞的污染检测和排除（三）培养细胞的污染检测和排除 二、细胞系的鉴定二、细胞系的鉴定 （三）培养细胞的污染检测和排除（三）培养细胞的污染检测和排除 培养细胞的污染：混入培养环境中对细胞生长有害培养细胞的污染：混入培养环境中对细胞生长有害的成分和造成细胞不纯的异物，包括：的成分和造成细胞不纯的异物，包括：微生物（真菌、细菌、病毒和支原体）微生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存非细胞所需的化学成分）化学物质（影响细胞生存非细胞所需的化学成分）细胞（非同一种的其他细胞）细胞（非同一种的其他细胞）常见微生物污染。微生物污染包括细菌、酵母菌、常见微生物污染。微生物污染包括细菌、酵母菌、霉菌霉菌和和病毒污染。无菌操作技术不当、操作室环境病毒污染。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要污染源主要污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境以及品质良好之严格之无菌操作技术、清洁的环境以及品质良好之细胞来源和培养基严格无菌配制是减低污染之最好细胞来源和培养基严格无菌配制是减低污染之最好方法。方法。1 1、微生物污染及其排除微生物污染及其排除 微生物污染的途径微生物污染的途径 微生物污染对细胞的影响微生物污染对细胞的影响 微生物污染的检测微生物污染的检测 微生物污染的防治微生物污染的防治 a.a.空气空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。的污染。b.b.器材器材：培养器皿、器械，：培养器皿、器械，COCO2 2培养箱。培养箱。c.c.操作操作：无菌观念不强。：无菌观念不强。d.d.血清血清：质量不好、检查不严。：质量不好、检查不严。e.e.组织样本组织样本：避免用碘消毒。：避免用碘消毒。由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗菌素的抗污染能力也有限，因而培养细胞一旦发生加入的抗菌素的抗污染能力也有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。污染多数将无法挽救。1 1）一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如果能一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如果能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。2 2）当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞质出现较多的颗粒状减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞质出现较多的颗粒状物质；较重者细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现了物质；较重者细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现了大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。3 3）不同微生物污染物对细胞的影响也有差别，支原体和病毒对不同微生物污染物对细胞的影响也有差别，支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期、缓慢和潜在的；霉菌和细菌细胞形态和机能的影响是长期、缓慢和潜在的；霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或是产生有毒物质繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或是产生有毒物质杀灭细胞。杀灭细胞。真菌的污染真菌的污染 真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一般肉眼可见。短期内培养液多不混浊。般肉眼可见。短期内培养液多不混浊。倒置显微镜下可见在细胞间有纵横交错穿行的丝状、管状倒置显微镜下可见在细胞间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝悬浮飘荡在培养液中。高倍镜下可见到很多及树枝状菌丝悬浮飘荡在培养液中。高倍镜下可见到很多菌丝有链状排列的菌珠，念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散菌丝有链状排列的菌珠，念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。在细胞周边和细胞之间生长。细菌污染细菌污染 细菌的污染较为多见是大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌细菌的污染较为多见是大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌等。加用抗菌素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌等。加用抗菌素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。的污染。一旦发生易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现一旦发生易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现明显混浊现象。明显混浊现象。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在。细胞生长停止并有有时在细胞表面和周围有大量细菌存在。细胞生长停止并有中毒表现。中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液向肉汤培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液向肉汤细菌培养基内滴加，细菌培养基内滴加，3737下培养检测是否污染。下培养检测是否污染。Fungus 支原体污染支原体污染 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2um0.2um）并）并独立生活的微生物。约有独立生活的微生物。约有1 1可通过滤菌器。无细胞壁，形态可通过滤菌器。无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，在光镜下不易看清呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，在光镜下不易看清内部结构。内部结构。支原体污染以后多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间。支原体污染以后多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间。培养液可不发生混浊，多数情况下，细胞病理变化轻微且可培养液可不发生混浊，多数情况下，细胞病理变化轻微且可由于传代、换液而缓解，易被忽视；个别严重者，可致细胞由于传代、换液而缓解，易被忽视；个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养皿脱落。增殖缓慢，甚至从培养皿脱落。确定有无支原体污染可做如下检测：相差显微镜检测、荧光确定有无支原体污染可做如下检测：相差显微镜检测、荧光染色法、电镜检查、染色法、电镜检查、DNADNA分子杂交检查等。分子杂交检查等。培养细胞的污染一旦明确，多数将无法救治，如果培养细胞的污染一旦明确，多数将无法救治，如果污染的细胞不是具有重要价值，一般发现污染后应污染的细胞不是具有重要价值，一般发现污染后应尽快弃之，以防污染扩大影响其它细胞。防止污染尽快弃之，以防污染扩大影响其它细胞。防止污染关键在于严格无菌操作，为防止污染和抢救有价值关键在于严格无菌操作，为防止污染和抢救有价值的细胞，目前一般可采用一下措施：的细胞，目前一般可采用一下措施：（1 1）抗生素）抗生素 （2 2）加温处理）加温处理 （3 3）动物体内接种）动物体内接种 细胞系特征及细胞系间交叉污染的测定细胞系特征及细胞系间交叉污染的测定 同工酶分析同工酶分析 血型及主要组织相容性抗原的测定血型及主要组织相容性抗原的测定 G G显带技术显带技术 DNADNA分析分析 二、细胞系的鉴定二、细胞系的鉴定 细胞系组织来源的鉴定细胞系组织来源的鉴定 具有特征性标志的超微结构分析具有特征性标志的超微结构分析 免疫学试验测定细胞骨架蛋白免疫学试验测定细胞骨架蛋白 组织特异性抗原的鉴定组织特异性抗原的鉴定 细胞特殊功能的生化检查方法细胞特殊功能的生化检查方法 细胞来源及特征数据的计算机化细胞来源及特征数据的计算机化 第四节第四节 动物细胞的低温保存动物细胞的低温保存 细胞的冷冻保存是细胞培养实验室的常用方法。细胞的冷冻保存是细胞培养实验室的常用方法。细胞冻存与细胞传代保存相比。可以减少人力、细胞冻存与细胞传代保存相比。可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。其经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。其原理是在低于原理是在低于-7070的超低温条件下，细胞内部的的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。生化反应极其缓慢，甚至终止。液体的固化有两种方式，一种是形成尖锐的冰晶，液体的固化有两种方式，一种是形成尖锐的冰晶，另一种是进入无定形的玻璃化状态。根据冻存液在另一种是进入无定形的玻璃化状态。根据冻存液在冻结后是否形成冰晶，冻存细胞可分为两种方法：冻结后是否形成冰晶，冻存细胞可分为两种方法：非玻璃化冻存非玻璃化冻存 玻璃化冻存玻璃化冻存 冰晶损伤：冻存细胞过程中，因细胞内水分结冰形成冰晶损伤：冻存细胞过程中，因细胞内水分结冰形成冰晶而致的细胞损伤，包括细胞膜和细胞器的损伤。冰晶而致的细胞损伤，包括细胞膜和细胞器的损伤。溶质损伤：冻存细胞过程中，因细胞外水分结冰形成溶质损伤：冻存细胞过程中，因细胞外水分结冰形成冰晶，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高而引起的冰晶，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高而引起的细胞损伤。细胞损伤。非玻璃化冻存 一、非玻璃化冻存一、非玻璃化冻存 （一）非玻璃化冻存原理（一）非玻璃化冻存原理 非玻璃化低温冻存和复苏细胞的原则：非玻璃化低温冻存和复苏细胞的原则：缓慢降温，快速复苏缓慢降温，快速复苏 在冻存液中加入冷冻保存剂在冻存液中加入冷冻保存剂 缓慢冷冻过程中：缓慢冷冻过程中：细胞外水分先结冰胞外电解质浓度升高细胞内水分渗出细胞外水分先结冰胞外电解质浓度升高细胞内水分渗出 在细胞外形成冰晶减少胞内冰晶的形成，减少胞内冰晶损伤在细胞外形成冰晶减少胞内冰晶的形成，减少胞内冰晶损伤 快速复苏过程中：快速复苏过程中：避免原有冰晶融化后，又以新的晶核为中心形成更大结晶即水避免原有冰晶融化后，又以新的晶核为中心形成更大结晶即水 的重结晶现象，减少冰晶损伤，提高冻存细胞的复苏率的重结晶现象，减少冰晶损伤，提高冻存细胞的复苏率 慢冻快融以及冷冻保护剂的作用慢冻快融以及冷冻保护剂的作用 冷冻保护剂的应用：冷冻保护剂的应用：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。首先要求对细胞没有是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。首先要求对细胞没有