THPCIA 004-2021 化妆品 急性毒性的测定 斑马鱼胚法.pdf

ICS：71.100.70Y40团体标准团体标准T/HPCIA 004-2021化妆品 急性毒性的测定 斑马鱼胚法Cosmetics-Determination of acute toxicity-Zebrafish(Danio rerio)embryo assay2021 年 05 月 07 日发布2021 年 05 月 07 日实施广州开发区黄埔化妆品产业协会广州开发区黄埔化妆品产业协会发布全国团体标准信息平台目次前言.31.范围.42.术语和定义.43.规范性引用文件.44.方法原理.45.生物模型.46.材料试剂.57.仪器设备.58.实验过程.59.结果计算.610.质量控制.711.废弃物处置.7附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图.8附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图.9附录 C（资料性附录）判定标准参考图.10附录 D（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法.11附录 E（资料性附录）数据记录表.12附录 F（资料性附录）斑马鱼养鱼及维护.13全国团体标准信息平台前言本标准是GB/T 1.1-2020给出规则起草。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会提出。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会归口。本标准起草单位：广州环亚化妆品科技有限公司、广东科玮生物技术股份有限公司、曼秀雷敦（中国）药业有限公司、广州睿森生物科技有限公司、广州天玺生物科技有限公司、广东悠质检测技术有限公司、润本生物技术股份有限公司、广东袋鼠妈妈生物科技有限公司、广州市暨优生物科技有限公司、广州奥蓓斯化妆品有限公司、广州鲁比生物科技有限公司、广州度普化妆品科学研究院、广州市络捷生物科技有限公司、广东省保化检测中心有限公司、广东药科大学、广东省人民医院、暨南大学化妆品与美容科学研究院。本标准主要起草人：郑伟东、梅文杰、陈亮、刘芳、杨银、金学迎、谢水林、史学东、张娇、徐晓龙、孙永、何斌、王芬、黄晓婷、刘宁芝、袁婵龄、邹俊、黄裕、赵海山、张逸波。全国团体标准信息平台化妆品 急性毒性的测定 斑马鱼胚法化妆品 急性毒性的测定 斑马鱼胚法1.范围本标准规定了评价化妆品急性毒性的斑马鱼胚实验的方法原理及操作。本标准适用于化妆品（膏霜、乳液、凝胶、精华，等）及化妆品原料的急性毒性评价。2.术语和定义2.1.hpf受精后小时数的英文缩写，即“hours post-fertilization”。2.2.累计孵化率 Cumulative hatching rate累计孵化胚胎数与存活胚胎数的比率。2.3.累计畸形率 Cumulative deformity rate累计死亡胚胎数与累计畸形胚胎数之和占胚胎总数的比率。2.4.累计死亡率 Cumulative mortality rate累计死亡胚胎数占胚胎总数的比率。2.5.累计存活率 Cumulative survival rate累计死亡率的 100%的相反比数。2.6.半数致死浓度（LC50）Half lethal concentration引起 50%受试鱼胚死亡的浓度。3.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化妆品安全技术规范（2015 版）QB/T 1684-2015 化妆品检验规则HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法GB/T 13267-1991 水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法DB32T 3979-2021 实验用 斑马鱼 饲育技术条件OECD 236 Fish Embryo Acute Toxicity(FET)Test4.方法原理使用 6 孔细胞培养板，在空白对照或溶剂对照控制的条件下，将 68 hpf 的斑马鱼胚胎置于不同浓度的样品中，在 280.5 的条件下培养 72 h，根据胚胎对受试样品的毒性反应（胚胎的存活、发育、畸形情况）计算出累计存活率、累计孵化率及累计畸形率，表征样品的急性毒性。5.生物模型5.1 成鱼采用性成熟、健康无畸形、产卵量高、产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish（Daniorerio）成鱼（418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬全国团体标准信息平台色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。5.2 鱼胚实验鱼胚为处于 68 hpf 时期发育正常的受精卵，实物鉴别参考附录 A。5.3 鱼的养殖维护斑马鱼养殖及维护参考附录 F。6.材料试剂6.1.材料6.1.1.斑马鱼交配盒，参考附录 B。6.1.2.胚胎收集器：100.0 mm 培养皿，参考附录 B。6.1.3.细胞培养板：24 孔细胞培养板：每孔容积 3.5 ml；6 孔细胞培养板：每孔容积 15.0 ml。6.1.4.离心管：50.0 ml。6.1.5.塑料滴管：3.0 ml，长约 150.0 mm。6.2.试剂除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用蒸馏水或去离子水。6.2.1.二甲基亚砜。6.2.2.3,4-二氯苯胺标准品（纯度98%）。6.2.3.氯化钠（NaCl）。6.2.4.氯化钾(KCl)。6.2.5.氯化钙(CaCl22H2O)。6.2.6.硫酸镁(MgSO47H2O)。6.2.7.标准稀释水。6.2.8.样品溶液6.3.1 样品储备液：将已知量的样品溶于一定体积蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜中。6.3.2 样品稀释液：用标准稀释水将样品储备液稀释成所需要的浓度。6.3.对照组溶液6.3.1空白对照组：标准稀释水标准稀释水配置方法：精密称取 17.2 g 氯化钠，0.76 g 氯化钾，2.9 g 氯化钙，4.9 g 硫酸镁，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至 1000 ml。取以上标准稀释水储备液 16.67 ml，再用蒸馏水或去离子水稀释至 1000 ml 即可。6.3.2溶剂（阴性）对照组：二甲基亚砜溶液（1%），水溶性样品无溶剂对照组。6.3.3阳性对照组：3,4-二氯苯胺标准储备溶液（4.0 mg/L）。精密称取 3,4-二氯苯胺标准品（纯度98%）4.0 mg，用标准稀释水溶解并定容至 1000 ml，静置24 h。7.仪器设备7.1.斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。7.2.连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。7.3.恒温培养箱：温度调至 280.5。7.4.冰箱：冷藏室 2 8；冰冻室-18。7.5.电子天平：精度 0.1 mg。7.6.pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。全国团体标准信息平台7.7.移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。7.8.温度计：0 50。7.9.实验室一般常规器材。8.实验过程8.1.胚胎准备斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。次日早晨打开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗置 100.0 mm 培养皿中，平均每个培养皿胚胎数量不超过 300 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。8.2.样品前处理参考附录 D 化妆品及原料前处理方法。8.3.实验方法8.3.1.预试验用标准稀释水把样品倍比稀释成连续多个浓度（稀释比为 2），每个浓度以 10 枚胚胎（24孔细胞培养板，1.0 ml 样品液）按照8.3.2部分进行试验，以预估胚胎累计死亡率0%100%所对应样品稀释的大致浓度范围。8.3.2.暴露实验在体视显微镜下用塑料滴管随机挑选 68 hpf 发育正常的胚胎用于实验（此时的胚胎为原肠期，参见附录 A）。使用 6 孔细胞培养板为实验载体，每孔加入胚胎 20 枚。用塑料吸管吸干养殖水后，每孔加入 5.0 ml 配制好的不同浓度的受试样品稀释液（57 个浓度）于上述 6 孔细胞培养板中，盖上盖板随后置于 280.5 恒温孵化箱中静置。各浓度组设置 3 个平行组，同时设置空白对照组或溶液对照组。于体视显微镜下（物镜 23 倍）观察和记录 24 hpf、48 hpf 及 72 hpf 的胚胎存活、孵化及畸形的情况，并计算累计存活率、累计孵化率及累计畸形率。8.4.判定标准8.4.1 测试终点以胚胎死亡为测试终点，表现形式为：胚胎凝结，体节形成缺失，尾部未分化和心跳停止的任一情形，见表 1。实物鉴别可参照附录 C1。表 1 测试终点表现形式8.4.2 畸形胚胎胚胎畸形表现形式为：脊柱弯曲，心包水肿，卵黄囊肿大，血管堵塞的任一情形，见表 2。实物鉴别可参照附录 C2。检测终点（胚胎死亡）卵黄凝结体节形成缺失尾部未分化心跳停止观察时期24 hpf+-48 hpf+72 hpf+注：”+”表示可以观察判断的现象，”-”表示未能观察判断的现象。全国团体标准信息平台表 2 胚胎畸形表现形式8.4.3 结果要求最低浓度样品的鱼卵累计存活率90%、最高浓度样品的鱼卵累计存活率15%。9.结果计算9.1.分别计算各组别中每个平行组的胚胎在 24、48 和 72 hpf 的累计存活率、累计孵化率和累计畸形率。a）累计存活率%=100%-（累计死亡胚胎数/胚胎总数*100%）b）累计孵化率%=累计孵化胚胎数/累计存活胚胎数*100%c）累计畸形率%=累计死亡胚胎数+累计畸形胚胎数）/胚胎总数*100%9.2.计算样品LC50，可采用统计方法（如二项式法、概率单位法）或分析软件（如 GraphPad Prism、SPSS）来计算。10.质量控制10.1.空白对照试验空白对照试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）24、48 和 72 hpf 时期，空白对照组斑马鱼胚胎存活率90%。b）72 hpf 时期，空白对照组斑马鱼胚胎孵化率80%。10.2.溶剂（阴性）对照溶剂（阴性）对照和阳性对照试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）24、48 和 72 hpf 时期，溶剂（阴性）对照组斑马鱼胚胎出现存活率90%。b）72 hpf 时期，溶剂（阴性）对照组斑马鱼胚胎孵化率80%。10.3.阳性对照a）72 hpf 时期，阳性对照组斑马鱼胚胎存活率15%。11.废弃物处置试验用斑马鱼胚于 28 冰水中灭活处理后按一般废弃物处置。具有急性毒性的样品、含有 3,4-二氯苯胺的废液按危险废物处置。畸形表现脊柱弯曲心包水肿卵黄囊肿大血管堵塞观察时期24 hpf-+-48 hpf-+72 hpf+注：”+”表示可以观察判断的现象，”-”表示未能观察判断的现象。全国团体标准信息平台附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图0 hpf（合子期）68 hpf（原肠期）24 hpf（体节期）48 hpf（孵化期）72 hpf（幼鱼）全国团体标准信息平台附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图外缸：225*115*115 mm内缸 220*110*85 mm挡板、外盖斑马鱼配种胚胎收集培养皿全国团体标准信息平台附录 C（资料性附录）判定标准参考图C1.测试终点鉴别参考图C1.测试终点鉴别参考图胚胎凝结体节形成缺失尾部未分化心跳停止C2.畸形胚胎鉴别参考图C2.畸形胚胎鉴别参考图脊柱弯曲心包水肿卵黄囊肿大血管堵塞（造成淤血）全国团体标准信息平台附录 D（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法D1.水溶性样品前处理方法使用标准稀释水将受试样品溶液倍比稀释（稀释比为 2）成连续多个实验浓度，现配现用。D2.非水溶性样品前处理方法取适量的二甲基亚砜将样品溶解，用蒸馏水或去离子水定容成一定浓度的受试样品储备液；二甲基亚砜在实验溶液中的最终浓度1%，具体依据样品的溶解度而定。再用标准稀释