TSHRH 015-2018 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法.pdf

ICS 71.100.70 C2682 Y42 上 海 日 用 化 学 品 行 业 协 会 团 体 标 准 T/SHRH 015-2018 _ 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法 Cosmetics-Tyrosinase Activity Inhibition Test Method 2018-12-01 发布 2018-12-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言 2 1.范围 3 2.原理 3 3.仪器 3 4.试剂 3 5 实验方法 3 6.结果计算 4 7.试验有效性验证 4 8.结果报告 5 2 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。本标准起草单位：上海家化联合股份有限公司、东阿阿胶股份有限公司、伽蓝（集团）股份有限公司、上海相宜本草化妆品股份有限公司、上海中翊日化有限公司、上海市质量监督检验技术研究院、玫琳凯（中国）有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物科技有限公司、汉高中国（投资）有限公司、广东博溪生物科技有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准主要起草人：陈媛祺、陈志涛、范倩文、廖峰、吴建铭、吕智、孙培文、林艺青、周泽琳、万向红、李琼、高宏旗、金坚、陈亦华 3 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法 1范围 本标准规定了酪氨酸酶活性抑制实验的基本技术要求。提供一种美白原料的评估方法，适用于宣称通过抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果的水溶性原料的功效评价。2.原理 在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化成多巴醌，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估原料对酪氨酸酶活性的抑制作用。3.仪器 分析天平：感量 0.1mg；试管：10mL；可调节移液枪：1.00mL；紫外可见分光光度计。4.试剂 除有另外说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。Na2HPO412H2O；一水合柠檬酸；pH6.8 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 0.2mol/L Na2HPO412H2O：14.33g 溶于 200mL 水，用玻棒搅拌至溶解；0.1 mol/L 一水合柠檬酸：2.1g 溶于 100mL 水，用玻棒搅拌至溶解；pH6.8 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：0.2mol/L Na2HPO412H2O 154.5 mL，加入 0.1 mol/L 一水合柠檬酸 45.5 mL，配制成 200mL 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；酪氨酸酶，活力1000unit/mg 固体；左旋多巴，纯度98%；酪氨酸酶溶液：用 pH6.8 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，100u/mL，临用配制；左旋多巴溶液：用 pH6.8 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，1mg/mL，避光保存；阳性对照：曲酸，纯度98.5%5.实验方法 4 阳性对照物用 pH6.8 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释成：1mg/mL、0.2mg/mL、0.04mg/mL、0.008mg/mL系列浓度梯度用以验证试验系统。受试物处理：受试物用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释为多级浓度样品。参照表 1，使用 10mL 试管设立样品管（T）、样品本底（T0）、酶反应管（C）和溶剂本底（C0），每一样品的每个受试浓度的样品管（T）需设立 3 支平行管，同时酶反应管（C）也需设立 3 支平行管。在样品管（T）和样品本底（T0）中各加入 1mL 相同浓度的样品溶液，酶反应管（C）和溶剂本底（C0）则分别加入 1mL 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。在样品管（T）和酶反应管（C）中各加入 0.5mL 酪氨酸酶溶液，样品本底（T0）与溶剂本底（C0）以 0.5mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代替，将样品和酪氨酸酶充分混匀，置 37水浴槽孵育 10 分钟。依次在各管中加入 2mL 的左旋多巴溶液，控制每管反应时间为 5 分钟，即刻将各管反应溶液移入比色皿中，在 475nm 处测定吸光值。表表 1 1 样品加液要求样品加液要求 T-样品管 T0-样品本底 C-DPPH 管 C0-溶剂本底 样品溶液（mL）1 1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（mL）0.5 1 1.5 酪氨酸酶溶液（mL）0.5 0.5 左旋多巴溶液（mL）2 2 2 2 平行次数 3/样 1/样 3/试验 1/试验 6.结果计算 计算酪氨酸酶抑制率：%100)T-T-1（）%抑制率（00CC（1）（1）式中：T样品管吸光值，即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值；T0样品本底吸光值；C酶反应管吸光值 3 次平均值，即未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值；C0溶剂本底吸光值。7.试验有效性验证 每批次实验都需要加入阳性对照的测试，阳性对照曲酸的 IC50（达到 50%抑制效果时对应的样品受试浓度）应在 0.05mg/mL-0.15mg/mL，则认为试验系统有效。5 根据公式（1）计算样品在各受试浓度下的酪氨酸酶抑制率，同时统计各组平行管间抑制率间的标准差（Standard Deviation，SD），SD 值须3%，则认为试验平行性有效。8.8.结果报告 样品在某一受试浓度下的对酪氨酸酶的抑制率应表述为：抑制率平均值抑制率间的标准差（SD）。对于样品抑制酪氨酸酶活性的表述，不应脱离受试浓度而言。在进行样品间抑制酪氨酸酶活性的比较时，绘制样品受试浓度与酪氨酸酶抑制率的浓度反应关系曲线，应用拟合公式（R20.9）计算各样品的 IC50，IC50越小代表活性越强。_