TNAIA 003-2020 肌肉中肌苷 肌苷酸的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.120 X22 团团 体体 标标 准准 T/NAIA 0032020 肌肉中肌苷肌肉中肌苷 肌苷酸的测定高肌苷酸的测定高效液相色谱法效液相色谱法 Determination of inosine and inosinic acid in muscle High performance liquid chromatography 2020-07-07发布 2020-08-01实施 宁宁夏化夏化学学分析分析测测试协会试协会 发发 布布 全国团体标准信息平台1前 言 本标准的编写格式符合 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分 标准的结构和编写规定编写。本标准由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本标准由宁夏大学、宁夏饲料工程技术研究中心、宁夏兽药饲料监察所、宁夏饲料工作站、宁夏农林科学院、宁夏昊标检测服务研究院、宁夏化学分析测试协会起草。本标准主要起草人：辛国省、卜姣姣、刘辉、燕翀、杨仪、丁园、高巧仙、王建林、武晓宏、谢荣国、张小飞、张艳、王京。本标准为首次发布。全国团体标准信息平台2肌肉中肌苷肌肉中肌苷 肌苷酸的测定肌苷酸的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了肌肉中肌苷 肌苷酸高效液相色谱法的测定。本标准适用于肌肉中肌苷 肌苷酸的测定。本方法检测限为：0.05g/kg。2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单位）适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9695.19 肉与肉制品、取样方法 3原理 肌肉组织中肌苷 肌苷酸经高氯酸溶液提取后，与碱反应生成化学状态稳定的肌苷酸钠，在 254nm波长下紫外检测器检测，外标法定量。4试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6682 规定的一级水 4.1高氯酸。4.25%高氯酸溶液：取 5mL 高氯酸加入 95mL 水中。4.3磷酸。4.4三乙胺。4.5甲醇（色谱纯）。4.6 肌苷标准品（纯度不低于 99.0%）。4.7 肌苷标准储备液（0.8mg/mL）：称取肌苷标准品（4.6）20mg（准确至 0.1mg）于 25mL容量瓶中，用水定容。置于 4冰箱保存，有效期 3 个月。4.8 肌苷酸标准品（纯度不低于 99.0%）。4.9 肌苷酸标准储备液（1mg/mL）：称取肌苷酸标准品（4.8）50mg（准确至 0.1mg）于 50mL容量瓶中，用水定容。置于 4冰箱保存，有效期 3 个月。4.10 氢氧化钠。4.11 氢氧化钠溶液：2mol/L。4.12 磷酸三乙胺混合溶液：分别取 3.5mL 磷酸（4.3）和 7.2mL 三乙胺（4.4），加入 200mL水中混匀，用三乙胺（4.4）调 pH 至 6.5，用水定容至 1L。5仪器和设备 5.1实验室用粉碎机或研钵。5.2分析天平：感量 0.0001 g。全国团体标准信息平台35.3均质机。5.4高效液相色谱仪：配紫外检测器。5.5高速离心机。5.6超声波。5.7容量瓶：50mL、25mL。5.8移液管：玻璃移液管 0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL。5.9砂芯过滤装置。6试样制备与保存 取肌肉组织，加液氮研磨或粉碎后置于-80冰箱备用。注：在采样和制备过程中，应避免试样污染，如长途运输应加液氮或冰袋保存。7测定步骤 7.1试样提取 平行做两份试验。称取 2g（准确至 0.0001g），置于 50mL 离心管中，用 20mL预冷的5%高氯酸溶液（4.2）分 3次匀浆，匀浆液在 4下以 4000r/min 离心 10min，上清液转入50mL烧杯中，合并上清液，用氢氧化钠溶液（4.11）调pH 至 6.5，用蒸馏水定容至50mL，摇匀，经0.45m 滤膜过滤装入进样小瓶待测。随同试样进行空白试验。除不称取样品外，均按试样步骤进行。7.2色谱条件 色谱柱：C18，长250mm，内径4.6mm，粒径5m，或性能相当；柱温：25；进样量：20l；流动相：磷酸三乙胺溶液（4.12）+甲醇（4.5）=95+5混匀，经0.45m滤膜过滤，超声波脱气；流速：1mL/min；检测波长：254nm。7.3标准系列溶液 准确吸取标准储备液（4.7、4.9）0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL肌苷 肌苷酸储备液分别置于 25mL 容量瓶中，用水定容。浓度分别为：肌苷：0g/mL、3.2g/mL、6.4g/mL、16g/mL、32g/mL、64g/mL。肌苷酸：0g/mL、4g/mL、8g/mL、20g/mL、40g/mL、80g/mL。现配现用。7.4测定 按照7.2给出参考色谱条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。7.5标准曲线绘制 试样溶液与标准溶液中肌苷、肌苷酸保留时间相对偏差在2.5%之内。在线性范围内，以肌苷、肌苷酸浓度为横坐标，以其响应值（峰面积）为纵坐标；绘制标准曲线，标准曲线相关系数不低于 0.999。8分析结果的计算 按式(1)计算试样中的肌苷、肌苷酸含量w，其数值用mg/kg表示。mvckgmgw)/()1(全国团体标准信息平台 54 式中：C:标准曲线下查的肌苷或肌苷酸浓度(g/mL）；V:试样定容体积(mL）；m:试样量，单位(g)。9重复性 在重复条件下完成两个平行测定结果的相对偏差不大于 5%。_ 全国团体标准信息平台