TJAASS 18-2021 液态乳及乳粉中维生素A、D、E的测定 在线固相萃取-中心切割二维液相色谱法.pdf

ICS 67.100CCS X 16团体标准T/JAASS 18-2021液态乳及乳粉中维生素 A、D、E 的测定 在线固相萃取-中心切割二维液相色谱法Determination of vitamin A,D,E in milk and milk powder by On-line solidphase extraction-heart cutting of two-dimensional liquid phasechromatography20211028 发布20211028 实施江苏省农学会江苏省农学会发 布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/JAASS 18-2021I目次前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 原理.15 试剂和材料.15.1 试剂.15.2 试剂配制.25.3 标准品.25.4 标准溶液配制.26 设备和仪器.37 分析步骤.37.1 试样制备.37.2 试样处理.37.3 色谱系统测试.47.4 色谱检测条件.68 分析结果表述.78.1 维生素 A、E 的含量计算.78.2 维生素 D 的含量计算.79 精密度.810 检出限和定量限.8附录 A（资料性附录）维生素 A、D、E 标准溶液浓度校正方法.9附录 B（资料性附录）仪器连接示意图和维生素 A、D、E 典型色谱图.10全国团体标准信息平台T/JAASS 18-2021II前言本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由南京市产品质量监督检验院提出。本文件由江苏省农学会归口。本文件起草单位：南京市产品质量监督检验院、上海市质量监督技术研究院、通标标准技术服务（上海）有限公司、内蒙古伊利实业集团股份有限公司、内蒙古欧世蒙牛乳制品有限责任公司。本文件主要起草人：徐美玲、张露、王晓丽、顾慧丹、闻伯芹、林毅侃、赵立苹、胡雪、贺满平、吴腾、陆秀凤、叶沐阳、陈良茜、江雪婷、郭园园、王飞轩。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/JAASS 18-20211液态乳及乳粉中维生素 A、D、E 的测定 在线固相萃取-中心切割二维液相色谱法1范围本文件规定了液态乳和乳粉中维生素A、D、E的测定原理及方法。本文件适用于液态乳和乳粉中维生素A、D、E的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品经皂化（含淀粉样品需酶解）后，直接进二维液相色谱系统，进行分离和分析，采用外标法定量。5试剂和材料5.1试剂5.1.1无水乙醇（C2H5OH）：色谱纯5.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯5.1.3甲醇（CH3OH）：色谱纯5.1.4甲酸（HCOOH）：色谱纯5.1.5抗坏血酸（C6H8O6）：分析纯5.1.62，6-二叔丁基对甲基苯酚（BHT）：分析纯5.1.7磷酸：分析纯全国团体标准信息平台T/JAASS 18-202125.1.8氢氧化钾（KOH）：分析纯5.1.9甲基叔丁基醚（MTBE）：色谱纯5.1.10淀粉酶：活力单位100 U/mg5.1.11水：GB/T 6682 规定的一级水5.2试剂配制5.2.150%无水乙醇溶液：量取 50 mL 无水乙醇，加水定容至 100 mL。5.2.2氢氧化钾溶液（50 g/100 g）：称取 50 g 氢氧化钾，加入 50 mL 水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。5.3标准品5.3.1维生素 A 标准品视黄醇（C20H30O，CAS 号：68-26-8）：纯度95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2维生素 E 标准品5.3.2.1-生育酚（C29H50O2，CAS 号：10191-41-0）：纯度95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2.2-生育酚（C28H48O2，CAS 号：148-03-8）：纯度95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2.3-生育酚（C28H48O2，CAS 号：54-28-4）：纯度95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2.4-生育酚（C27H46O2，CAS 号：119-13-1）：纯度95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.3维生素 D 标准品5.3.3.1维生素 D2标准品：钙化醇（C28H44O，CAS 号：50-14-6），纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.3.2维生素 D3标准品：胆钙化醇（C27H44O，CAS 号：67-97-0），纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.4标准溶液配制5.4.1维生素 A 标准储备溶液（0.500 mg/mL）准确称取 25.0 mg 维生素 A 标准品，用无水乙醇溶解后，转移入 50 mL 容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度为 0.500 mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在-20C 下避光保存，有效期 1 个月。临用前将溶液回温至 20C，并进行浓度校正（校正方法见附录 A）。5.4.2维生素 E 标准储备溶液（1.00 mg/mL）全国团体标准信息平台T/JAASS 18-20213分别准确称取-生育酚、-生育酚、-生育酚、-生育酚标准品 50.0 mg，用无水乙醇溶解后，转移至 50 mL 容量瓶定容，此溶液浓度为 1.00 mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶种，密封后，在-20C 下避光保存，有效期 6 个月。临用前将溶液回温至 20，并进行浓度校正（校正方法见附录 A）。5.4.3维生素 D 标准储备溶液(100 g/mL)准确称取维生素 D2标准品 10.0 mg，用无水乙醇溶解后，转移至 100 mL 棕色容量瓶定容，得到维生素 D2标准储备液（浓度 100 g/mL）。准确称取维生素 D3标准品 10.0 mg，用无水乙醇溶解后，转移至 100 mL 棕色容量瓶定容，得到维生素 D3标准储备液（浓度 100 g/mL）。在-20C 下避光保存，有效期 6 个月。临用前将溶液回温至 20C，并进行浓度校正（校正方法见附录 A）。5.4.4维生素 A、D、E 混合标准溶液分别移取适量维生素 A、D、E 标准储备液于 100mL 容量瓶中用乙醇定容至刻度，得到维生素 A、D、E 混合标准溶液（维生素 A：1 g/mL，维生素 E：10 g/mL，维生素 D：0.05 g/mL）。5.4.5维生素 A、D、E 混合工作液分别移取适量维生素 A、D、E 混合标准溶液，用 50%乙醇水溶液逐级稀释成以下浓度：维生素 A（0.01 g/mL，0.025 g/mL，0.050 g/mL，0.100 g/mL，0.250 g/mL，0.500 g/mL）、维生素 D（0.5 ng/mL，1.25 ng/mL，2.5 ng/mL，5 ng/mL，12.5 ng/mL，25 ng/mL）、维生素 E（0.1 g/mL，0.250 g/mL，0.5 g/mL，1 g/mL，2.5 g/mL，5 g/mL）。6设备和仪器6.1在线固相萃取-中心切割二维液相色谱系统：含有三个独立输液泵、一个自动进样器（进样范围100L）、一个柱温箱、一个紫外检测器（或者二极管阵列检测器）和一个长光程（流通池光程60mm）二极管阵列检测器。6.2分析天平：感量 0.01 g 和 0.00001 g。6.3涡旋混合器。6.4锥形瓶：250 mL。6.5容量瓶：100 mL。6.6尼龙滤膜：0.22 m。7分析步骤7.1试样制备将一定数量的样品按要求混合均匀后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。7.2试样处理7.2.1液态乳全国团体标准信息平台T/JAASS 18-20214称取 10 g（精确至 0.01 g）液体试样于 250 mL 锥形瓶中，加入 1.0 g 抗坏血酸和 0.1 g BHT，混匀，加入 30 mL 无水乙醇，加入 1020 mL 氢氧化钾溶液，边加边摇匀，混匀后于 80C 恒温水浴震荡皂化30 min，皂化后立即用流水冷却至室温，皂化液转移至 100 mL 棕色容量瓶中，加 50%乙醇水溶液定容至刻度，混匀，10000 转/分钟离心 5-10min，上清液过 0.22 m 尼龙滤膜上样。7.2.2乳粉称取2 g5 g（精确至0.01 g）试样于250 mL锥形瓶中，加入约20 mL温水混匀，加入1.0 g 抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀，加入30 mL无水乙醇，加入1020 mL氢氧化钾溶液，边加边摇匀，混匀后于80C恒温水浴震荡皂化30 min，皂化后立即用流水冷却至室温，皂化液转移至100 mL棕色容量瓶中，加50%乙醇水溶液定容至刻度，混匀，10000转/分钟离心5-10min，上清液过0.22 m尼龙滤膜上样。注：一般皂化时间为30min，如皂化液冷却后表面有浮油，需要加入适量的氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。7.3色谱系统测试7.3.1流路连接（见附录 B 图 1）7.3.2系统测试条件7.3.2.1在线固相萃取柱（SPE）：PLRP-S，4.612.5 mm，15-20 m 或等效柱7.3.2.2一维分析柱：Poroshell 120 PFP，4.6100 mm，4 m 或等效柱7.3.2.3捕获柱：Poroshell 120 EC-C18，4.65 mm，4 m 或等效柱7.3.2.4二维分析柱：Zorbax Eclipse Plus PAH，2.1100 mm，3.5 m 或等效柱7.3.2.5柱温：35C7.3.2.6SPE 泵流动相流速及梯度见表 17.3.2.7一维流动相流速及梯度见表 27.3.2.8二维流动相流速及梯度见表 37.3.2.9阀位置：阀 1：0 min（位置 1-6）；4.5 min（位置 1-2）；5.9 min（位置 1-6）；阀 2：0-25 min（位置 1-6）。7.3.2.10进样量：100 L7.3.2.11检测波长：一维：0-12 min：325 nm；12-15 min：264 nm（根据维生素 D 保留时间调整）；15-25 min：294 nm。二维：264 nm。全国团体标准信息平台T/JAASS 18-20215表 1 SPE 泵流动相流速及梯度时间min流速mL/min流动相 A：水%流动相 B：乙腈%流动相 C：甲醇%流动相 D：甲基叔丁基醚%0.01.02008004.01.02008004.11.01090008.01.01090008.51.0010000151.001000016.01.0090010201.009001021.01.0200800251.0200800表 2 一维液相色谱流动相流速及梯度时间min流速mL/min流动相 A：0.1%磷酸水溶液%流动相 B：甲醇%0.00.570306.50.570307.01.0257517.01.0109019.01.0010022.01.00100表 3 二维液相色谱流动相流速及梯度时间min流速mL/min流动相 A：乙腈%流动相 B：甲醇%0.00.401005.00.470306.00.4901025.00.49010全国团体标准信息平台T/JAASS 18-202167.3.3确定维生素 D 的切割窗口按 6.3.2 色谱条件按顺序分别进 1 针空白溶液，2 针维生素 A、D、E 混合标样，保证维生素 A、D、E 保留时间重复性后，得到维生素 D 的保留时间（约 13.7 min）。典型色谱图见附录 B 图 2 所示。7.3.4建立完整的维生素 A、D、E 分析方法根据图 2 结果确定维生素 D 捕获窗口并编