THBSC 001-2021 柑橘黄龙病非疫区保持技术规范.pdf

1.1.1 备案号：2021-002 湖 北 省 柑 桔 学 会 团 体 标 准 T/HBSC T/HBSC 0012021 柑橘黄龙病非疫区保持技术规范 Standard regulations for maintenance of citrus HLB-free areas 2021-06-17 发布 2021-10-01 实施 湖北省柑桔学会 发 布 全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 I 目目 次次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语与定义.1 3.1 柑橘黄龙病.1 3.2 黄龙病非疫区.1 3.3 无黄龙病柑橘苗木.1 4 黄龙病检疫管理.2 4.1 产地检疫.2 4.1.1 检疫申报.2 4.1.2 苗圃检疫.2 4.1.3 橘园检疫.2 4.2 调运检疫.2 4.3 落地复检.2 5 黄龙病监测.2 5.1 监测范围.2 5.2 监测点设置.3 5.3 监测时间.3 5.4 监测方法.3 6 柑橘木虱监测.3 6.1 监测时间.3 6.2 监测方法.3 7 疫情上报.3 8 黄龙病和柑橘木虱防除.3 8.1 黄龙病树清除.3 8.2 柑橘木虱防除.4 9 档案管理.4 附 录 A.5 附 录 B.8 附 录 C.9 全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 II 前前 言言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由湖北省柑桔学会提出并归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院果树茶叶研究所、湖北省植物保护总站、湖北省农业科学院植保土肥研究所、宜昌市农业技术推广中心、华中农业大学。本文件主要起草人：肖翠、仝铸、刘元明、孙中海、吕亮、杨玉丽、刘永忠、方国斌、张凯雄、王泽琼、邱文明、何秀娟。全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 1 柑橘黄龙病非疫区保持技术规范柑橘黄龙病非疫区保持技术规范 1 范围 本文件规定了湖北柑橘黄龙病检疫管理，黄龙病和柑橘木虱监测与防除的方法，以及疫情上报的程序。本文件适用于湖北柑橘黄龙病非疫区的保持，我国其他柑橘黄龙病非疫区可参考执行。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5040 柑橘苗木产地检疫规程 GB 15569 农业植物调运检疫规程 GB/T 35333 柑橘黄龙病监测规范 GB/T 35334 柑橘木虱(亚洲种)监测规范 NY/T 973 柑橘无病毒苗木繁育规程 NY/T 2920 柑橘黄龙病防控技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 柑橘黄龙病 citrus huanglongbing（HLB）柑橘黄龙病是指一种由韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter）引起，以柑橘木虱为传播媒介的细菌性检疫病害，可危害芸香科柑橘属、金柑属、枳属等植物，引起树冠顶部抽黄梢、叶片不对称斑驳黄化、果蒂周围果皮着橙红色而其他部分不能正常着色等典型症状。3.2 黄龙病非疫区 citrus HLB-free area 尚未发生柑橘黄龙病，并且能在一定时期内保持此状况的地区。3.3 无黄龙病柑橘苗木 HLB-free citrus nursery tree 参照 NY/T 973 繁育的经检疫部门检验不携带黄龙病菌的柑橘苗木。全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 2 4 黄龙病检疫管理 4.1 产地检疫 4.1.1 检疫申报 按照 GB 5040 的规定执行。4.1.2 苗圃检疫 非疫区内繁殖苗木所用接穗应全部采自无黄龙病的母本园或采穗圃，无黄龙病母本园和采穗圃的建立与管理参照 NY/T 973。苗圃地的选定、繁殖所用砧木种子和接穗的消毒、苗圃防疫措施等参照GB 5040。苗木繁育期间由植物检疫人员按照 GB 5040 规定的现场检验方法，定期进行柑橘黄龙病的抽查，发现病株应立即进行清除并封锁苗圃。苗木出圃前按照 GB 5040 和中华人民共和国国务院植物检疫条例的规定，实施产地检疫，未发现柑橘黄龙病的苗木，签发产地检疫合格证后方可出圃。4.1.3 橘园检疫 按照本文件中 5 和 6 所示方法对非疫区内柑橘果园进行黄龙病及木虱监测，对有疫情的，立即进行封锁，并按照本文件中 7.1 和 7.2 所示方法进行防除。4.2 调运检疫 从非疫区外调入柑橘苗木、接穗和果实，必须符合 GB 15569 和植物检疫条例的规定，调出单位或个人需向当地植物检疫机构提出申请，经检疫人员按照 GB 15569 规定进行现场检查和/或室内检验检测未发现柑橘黄龙病且办理植物检疫证书后方可调入。4.3 落地复检 作为生产建园调入的苗木，必须由调入地区检疫部门进行落地复检；作为种质资源调入的遗传材料，经落地复检后需统一放置 40-50 目防虫网室内隔离观察 3 年，定期进行黄龙病监测，确定无黄龙病发生后方可进行定植。5 黄龙病监测 5.1 监测范围 湖北省柑橘产区。全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 3 5.2 监测点设置 在湖北省内有柑橘种植的地区均需设置监测点；主产区柑橘种植面积达 5 万亩，至少设置 1 个监测点；与黄龙病疫区毗邻的县市，柑橘种植面积达 5000 亩，至少设置 1 个监测点，零星种植的地区适当设置监测点。5.3 监测时间 按照GB/T 35333的规定执行。5.4 监测方法 根据GB/T 35333开展访问调查，发现有疑似症状的（附录A），需进行重点踏查。在田间踏查时，采集具有典型症状的叶片和果实，经75%酒精消毒后保存样品带回实验室，进行分子鉴定（附录C）。6 柑橘木虱监测 监测范围和监测点设置参照5.1和5.2。6.1 监测时间 按照GB/T 35334的规定执行。6.2 监测方法 根据GB/T 35334开展访问调查，对疑似柑橘木虱发生的区域进行重点调查。利用放大镜对嫩梢进行观察，根据柑橘木虱卵、若虫及成虫的形态特征（附录B）进行鉴定，并对是否携带柑橘黄龙病菌进行分子鉴定（附录C）。7 疫情上报 在黄龙病和柑橘木虱监测调查中，对所发现的疫情应立即逐级上报。县级植物检疫机构应对疫情发生时间、地点、范围、程度等详细情况书面报告至省级植物检疫机构，由省级植物检疫机构组织专家调查鉴定确认后报国家植物检疫机构备案。8 黄龙病和柑橘木虱防除 根据上述黄龙病和柑橘木虱的监测情况，对有疫情的，立即进行封锁。8.1 黄龙病树清除 按照NY/T 2920的规定执行。全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 4 8.2 柑橘木虱防除 根据NY/T 2920，在新梢萌发关键期（待新芽抽出2cm左右时），以及在柑橘采果后冬季清园时，选用拟除虫菊酯类和新烟碱类等低毒药剂进行全园喷施，防治柑橘木虱。同时兼顾各种虫态，合理搭配药剂，并注意药剂的轮换使用，延缓抗药性的发生，越冬代成虫可选用石硫合剂、矿物油、松脂酸钠等进行防治，梢期防治可选用触杀兼具内吸性农药。同时应对有柑橘木虱疫情的柑橘果园地面及周边杂草同时快速喷药，防止柑橘木虱的短暂逃避。9 档案管理 对非疫区黄龙病和柑橘木虱的调查、监测、疫情发生情况及防控等涉及到的所有原始资料以及采集到的标本都必须存档保存。全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 5 附 录 A 柑橘黄龙病的田间症状 A.1 叶片症状（图 A.1）感染柑橘黄龙病后，叶片沿叶脉附近和叶片基部形成黄绿相间不对称的斑驳黄化症状。图 A.1 柑橘黄龙病叶片不对称斑驳黄化症状（图片由肖翠拍摄）全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 6 A.2 枝梢症状（图 A.2）柑橘黄龙病枝梢发病呈现自树冠顶端向下发病的趋势，发病早期往往首先在树冠顶部出现少数几枝黄梢，叶片呈现均匀黄化症状。（图片源于网络）（图片由肖翠拍摄）图 A.2 柑橘黄龙病早期树冠顶部黄梢症状 全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 7 A.3 果实症状（图 A.3）感染黄龙病的柑橘果实果蒂周围果皮着色而其他部分不能正常着色，形成“红鼻子”果。图 A.3 柑橘黄龙病“红鼻子”果症状（图片由王雨亭提供）全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 8 附 录 B 柑橘木虱亚洲种的形态特征 B.1 解剖镜下形态（图 B.1）柑橘木虱亚洲种的虫卵长约 0.3mm，橙黄色，芒果形；若虫长约 0.3-2mm，共分五龄，虫体黄色，复眼红色，扁椭圆形，背面略隆起呈龟背状，腹部周缘常有白色腊丝排出；成虫长约 3-4mm，体呈青灰色，密布褐色斑纹，头顶突出如剪刀状，复眼暗红色，单眼 3 个，橘红色，停息时尾部翘起，与停息面成 45角。图 B.1 解剖镜下柑橘木虱亚洲种的卵、若虫、成虫形态（图片由肖翠根据网络图片整理）全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 9 附 录 C 柑橘黄龙病亚洲韧皮部杆菌的分子鉴定 C.1 样品采集 C.1.1 田间采样 C.1.1.1 叶片样品采集 具有典型黄龙病症状的叶片，直接采集带病叶的枝条。对无典型黄龙病症状的果园，根据五点随机取样法，按果园总株数的 2%进行随机抽样，在抽样柑橘树的东南西北中五个方向分别取 1 根同时带有老叶、成熟叶、嫩叶的枝条，混合成一个样品。对无典型黄龙病症状的苗圃，按照 GB5040 的规定进行随机抽样，对抽样苗木采集少许带叶枝条，每十株苗木样品混合成一个样品。采集的叶片样品，经 75%酒精擦拭，且确保无柑橘木虱卵、各级若虫、成虫后，放入自封袋，喷少许无菌水保持样品湿度，两天内送至实验室进行样品的前处理和保存。采集样品所用枝剪，每采集完一个样品均需用 75%酒精消毒，避免样品间交叉污染。C.1.1.2 果实样品采集 具有典型黄龙病症状的果实，直接采集病果。对无典型黄龙病症状的果园，根据五点随机取样法，按果园总株数的 2%进行随机抽样，在抽样柑橘树的东南西北中五个方向分别取 1 个果，混合成一个样品。对果品市场的商品鲜果，每批果实按照 1%进行随机抽样，每 10 个果实混合成一个样品。采集的果实样品，经 75%酒精擦拭后，放入自封袋，两天内送至实验室进行样品的前处理和保存。C.1.1.3 柑橘木虱采集 在有柑橘木虱发生的果园，在新梢抽发期按果园总株数的 2%进行随机抽样，在每株抽样柑橘树采集 20 头成虫或若虫混合成一个样品。对调运苗木、接穗、带叶鲜果等材料中发现的柑橘木虱成虫或若虫，则直接进行收集，每 20 头混合成一个样品。将收集的柑橘木虱放进装有 75%酒精的 2ml 离心管浸泡 30min 固定杀死后，倒掉酒精进行封装，两天内送至实验室进行样品的前处理和保存。C.1.2 实验室样品前处理与保存 对带叶枝条样品，摘取叶片，用流水冲洗干净后，再用灭菌去离子水漂洗两遍，切取主叶脉和叶柄，对果实样品，则收集白皮层和果中轴，分别用锡箔纸包好后，用液氮速冻，保存于-80。木虱样品则直接用液氮速冻，保存于-80。C.2 样品 DNA 的提取 参照 CTAB 法并稍作修改后提取 DNA：取柑橘组织（主叶脉+叶柄或者白皮层+果中轴）或柑橘木虱，迅速用液氮反复研磨至细粉末状，取 100 mg 立即转移至预冷的 2 mL 离心管；加入 1 mL CTAB 裂解液并迅速振荡混匀，于 64 水浴 45-60 min；12000 rpm 离心 10 min，吸取上清液至新的 2 mL 离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀；12000 rpm 离心 10 min，吸取上清液至 1.5 mL 离心管，全国团体标准信息平台T/HBSC 0012021 10 加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-20 静置 30-60 min，12000 rpm 离心 10 min，弃上清；加入 800 L 75%酒精，7500 rpm 离心 5 min，弃上清液（此步骤重复两次）；吸尽上清液，于室温下风干，加入 30 L dd H2O 溶解