THPCIA 006-2021 化妆品 温和刺激性的测定 斑马鱼胚法.pdf

ICS：71.100.70Y40团体标准团体标准T/HPCIA 006-2021化妆品 温和刺激性的测定 斑马鱼胚法Cosmetics-Mild irritation-Zebrafish(Danio rerio)embryo assay2021 年 05 月 07 日发布2021 年 05 月 07 日实施广州开发区黄埔化妆品产业协会广州开发区黄埔化妆品产业协会发布全国团体标准信息平台目次前言.31 范围.42 术语和定义.43 规范性引用文件.44 方法原理.45 生物模型.46 材料试剂.47 仪器设备.58 实验过程.59 结果计算.610 质量控制.611 废弃物处置.7附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图.8附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图.9附录 C（资料性附录）判定标准参考图.10附录 D（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法.11附录 E（资料性附录）数据记录表.12附录 F（资料性附录）斑马鱼养鱼及维护.13全国团体标准信息平台前言本标准是GB/T 1.1-2020给出规则起草。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会提出。本标准由广州开发区黄埔化妆品产业协会归口。本标准起草单位：澳思美日用化工（广州）有限公司、广州睿森生物科技有限公司、广东袋鼠妈妈生物科技有限公司、润本生物技术股份有限公司、广州市暨优生物科技有限公司、广州奥蓓斯化妆品有限公司、广州市络捷生物科技有限公司、广州易和生物科技有限公司、广州鲁比生物科技有限公司、广州度普化妆品科学研究院、广州市络捷生物科技有限公司、广东省保化检测中心有限公司、广东药科大学、广东省人民医院、暨南大学化妆品与美容科学研究院。本标准主要起草人：郑伟东、梅文杰、肖德凯、黄伟雄、谢水林、孙永、王俊林、何斌、王芬、黄裕、罗欣茹、杨涛、黄晓婷、刘宁芝、袁婵龄、邹俊、黄裕、赵海山、陈小佳。全国团体标准信息平台化妆品 温和刺激性的测定 斑马鱼胚法1 范围本标准规定了评价化妆品温和刺激性的斑马鱼胚实验的方法原理及操作。本标准适用于化妆品（膏霜、乳液、凝胶、精华，等）及化妆品原料的温和刺激性评价。2 术语和定义2.1.hpf受精后小时数的英文缩写，即“hours post-fertilization”。2.2.累计死亡率 Cumulative mortality rate累计死亡胚胎数占胚胎总数的比率。2.3.摆动次数斑马鱼卵黄囊位置的移动的次数，即为摆动次数。3 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化妆品安全技术规范（2015 版）QB/T 1684-2015 化妆品检验规则DB32T 3979-2021 实验用 斑马鱼 饲育技术条件OECD 236 Fish Embryo Acute Toxicity(FET)Test4 方法原理使用 24 孔细胞培养板，在空白对照或阳性对照控制对照的条件下，将 24 hpf 的斑马鱼胚胎置于不同的样品中，在体式显微镜下观察（5 min 内），根据胚胎对受试样品的温和刺激性反应（胚胎的刺激摆动、凝结（死亡）情况）记录好鱼胚刺激摆动（卵黄囊位置的移动）的次数和鱼胚死亡（凝结）数量，表征样品的温和刺激性。5 生物模型5.1 成鱼采用性成熟、健康无畸形、产卵量高、产卵质量好的野生型斑马鱼 zebra fish（Danio rerio）成鱼（418 个月）进行产卵。成鱼的体长 35 cm，雄鱼体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。雌鱼体型丰满，腹部膨大、银亮，体色为银灰色。5.2 鱼胚实验鱼胚为处于 24 hpf 时期发育正常的受精卵，实物鉴别参考附录 A。5.3 鱼的养殖维护斑马鱼养殖及维护参考附录 F。6 材料试剂全国团体标准信息平台6.1 材料6.1.1 斑马鱼交配盒。（参考附录 B）6.1.2 胚胎收集器：100.0 mm 培养皿。（参考附录 B）细胞培养板：24 孔细胞培养板：每孔容积 3.5 ml。6.1.3 塑料滴管：3.0 ml，长约 150.0 mm。6.2 试剂除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。6.2.1.氯化钠（NaCl）。6.2.2.氯化钾（KCl）。6.2.3.氯化钙（CaCl22H2O）。6.2.4.硫酸镁（MgSO47H2O）。6.2.5.标准稀释水。6.3 对照组溶液6.3.1.空白对照组：标准稀释水。标准稀释水配置方法：精密称取 17.2 g 氯化钠，0.76 g 氯化钾，2.9 g 氯化钙，4.9 g 硫酸镁，用蒸馏水或去离子水溶解并定容至 1000 ml。取以上标准稀释水储备液 16.67 ml，再用蒸馏水或去离子水稀释至 1000 ml 即可。6.3.2 阳性对照组：十二烷基硫酸钠（SDS）标准储备溶液（5.0 mg/ml)。7 仪器设备7.1 斑马鱼养殖系统：包括制水、储水、供水、排水及水循坏系统。7.2 连续变倍体视显微镜（带拍照功能）：最小放大倍数为目镜 230，物镜 1。7.3 恒温培养箱：温度调至 280.5。7.4 冰箱：冷藏室 2 8；冰冻室-18。7.5 电子天平：精度 0.1 mg。7.6 pH 计：测量范围 014,最小分度为 0.01 pH 单位。7.7 移液枪：0.5 l10 l、10 l100 l、100 l1000 l、1000 l5000 l。7.8 温度计：0 50。7.9 实验室一般常规器材。8 实验过程8.1 胚胎准备8.11 斑马鱼配种时，产卵盒外缸预先加入 2/3 的养殖水，接着套入带有胚胎分离作用的内缸，插入挡板，隔开雌雄两鱼。于实验前一天晚上选取大于 4 个月的性成熟的待配种斑马鱼按照 1:1 或 1:2 的雌雄比置于带有挡板的产卵盒中过夜，避光。8.12 次日早晨打开光源，抽出产卵盒的挡板使之进行交配产卵。交配 1 h 后，检查各缸成鱼产卵情况，用漏网勺收集斑马鱼交配产生的胚胎,养殖水冲洗置 100.0 mm 培养皿中，平均每个培养皿胚胎数量不超过 300 枚。清除培养皿中的异物后，放入恒温培养箱里孵育。8.2 样品前处理参考附录 D 化妆品及原料前处理方法。8.3 实验方法8.3.1 实验过程在体视显微镜下用塑料滴管随机挑选 24 hpf 发育正常的胚胎用于实验（此时的胚胎为体节期，参见附录 A）。使用 24 孔细胞培养板为实验载体，每孔加入胚胎 1020 枚。全国团体标准信息平台用塑料吸管吸干标准稀释水后，每孔加入 1.0 ml 配制好的不同的受试样品液于上述 24 孔细胞培养板中，静置。各浓度组设置 3 个平行组，同时设置空白对照组或溶液对照组。于体视显微镜下（物镜 23 倍）观察（5 min 内）和记录胚胎刺激摆动（卵黄囊位置的移动）及凝结（死亡）的情况。8.3.2 判定标准测试终点和评价指标以胚胎凝结和 5 min 为测试终点，表现形式为：胚胎刺激摆动，凝结（死亡）的任一情形，见表 1。实物鉴别参见附录 C。表 1 测试终点和评价指标终点反应终点评分刺激性分类评价指标鱼胚（死亡或凝结率)和/或(摆尾次数)（D 和/或 W）-无刺激性D=0.0%；D50%与空白对照组无显著性差异；W空白对照组且与空白对照组无显著性差异+轻微刺激性D50%（与空白对照组有显著性差异）；W空白对照组且与空白对照组无显著性差异+轻度刺激性D50%（与 D=50%组无显著性差异）；W 与空白对照/阳性对照相比有显著性差异+中度刺激性D=50.0%；D50%（与阳性对照组有显著性差异）；W 与空白对照组/阳性对照相比有显著性差异+强刺激性D=100.0%；D50%（与阳性对照组无显著性差异）；W 与空白对照/阳性对照相比有显著性差异8.3.3 结果要求视频录像的画面中出现的鱼胚位于画面正中间，不损伤鱼胚使得鱼胚正常进行正式实验。9 结果计算全国团体标准信息平台9.1 分别记录及计算各组别中每个平行组的胚胎（24 hpf）在 5 min 内的累计刺激摆动次数、累计死亡率。a）累计死亡率%=累计死亡胚胎数/胚胎总数*100%9.2 使用 GraphPad Prism 8 统计分析软件(或类似功能工具)对累计刺激摆动次数和累计死亡率进行统计分析，数值用均值标准误（MeanSEM）表示。10 质量控制10.1 空白对照试验空白对照试验结果符合下列要求，结果方有效。否则，应查明原因后重新进行试验。a）5 min 时期，空白对照组斑马鱼胚胎死亡率10%。10.2 阳性对照a）5 min 时间内，阳性对照组斑马鱼胚胎死亡率90%。11 废弃物处置试验用斑马鱼胚于 28 冰水中灭活处理后按一般废弃物处置。具有温和刺激性的样品、含有十二烷基硫酸钠（SDS）的废液按危险废物处置。全国团体标准信息平台附录 A（资料性附录）胚胎正常发育参考图0 hpf（合子期）68 hpf（原肠期）24 hpf（体节期）48 hpf（孵化期）72 hpf（幼鱼）全国团体标准信息平台附录 B（资料性附录）产卵盒参考示意图外缸：225*115*115 mm内缸 220*110*85 mm挡板、外盖斑马鱼配种胚胎收集培养皿全国团体标准信息平台附录 C（资料性附录）判定标准参考图C1.测试终点鉴别参考图胚胎凝结（死亡）全国团体标准信息平台附录 D（资料性附录）化妆品及原料前处理参考方法D1.水溶性样品前处理方法使用标准稀释水将受试样品稀释成实验浓度，现配现用。D2.非水溶性样品前处理方法取适量的二甲基亚砜将样品溶解，用馏水或去离子水定容成一定浓度的受试样品储备液；二甲基亚砜在实验溶液中的最终浓度1%，具体依据样品的溶解度而定，现配现用。全国团体标准信息平台附录 E（资料性附录）数据记录表斑马鱼胚胎温和刺激性试验记录表样品信息试验时间_年_月_日 至 _年_月_日仪器名称及型号结果显示累计刺激摆动次数时间样品平行组 1平行组 2平行组 3平均数：累计死亡率（%）时间样品平行组 1平行组 2平行组 3平均数：质量保证及质量控制空白对照组在 5 min 累计死亡率为_%是否满足指控要求（死亡率10%）是否阳性对照组在 5 min 累计死亡率为_%是否满足指控要求（死亡率90%）是否试验人员_审核人员_全国团体标准信息平台附录 F（资料性附录）斑马鱼养殖及维护F1.温度F1.温度水温适宜范围：2430；鱼房室温范围：2527；观察胚胎发育最佳温度：280.5。F2.pHF2.pH耐受范围：6.09.5；养殖范围：7.08.0。F3.电导率F3.电导率养殖范围：200.01700.0 S/cm；最适范围：500.0800.0 S/cm。F4.光周期和光照强度F4.光周期和光照强度光周期：14 h 光照和 10 黑暗；光照强度 54324 lux。F5.活饵F5.活饵以市售丰年虫为种鱼饵料，按所购商品说明孵化丰年虫后喂食。F6.产卵周期F6.产卵周期三个月龄的斑马鱼可达到性成熟，选择鱼龄 4 月18 月的雌雄成鱼配对，产卵后为保证获取足量的胚胎，应 1 周2 周才能重新配对产卵。全国团体标准信息平台