THBJC 003-2020 畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法.pdf

ICS 13.040.20Z 10 T/HBJCHBJC 黑 龙 江 省 标 准 技 术 创 新 协 会 团 体 标 准 T/HBJC 0032020畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法2020-12-01 发布2020-12-16 实施黑龙江省标准技术创新协会发 布全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/HBJC 0032020I 目次 前言.II引言.III1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 原理.15 试剂和材料.16 仪器和设备.27 样品.28 检测方法.2 9试验数据处理.3 10 检测结果与分析.4 11 质量保证与质量控制.4 附录 A（规范性附录）原始采集数据格式参考.5全国团体标准信息平台全国团体标准信息平台T/HBJC 0032020II 前 言 本文件依据GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些部分可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由东北农业大学提出。本文件由黑龙江省标准技术创新协会归口。本文件主要起草单位：东北农业大学、黑龙江省菌益粮康科技发展有限公司。本文件起草人:魏自民、温铁军、张旭、史明子、齐海石、吴迪。全国团体标准信息平台T/HBJC 0032020III 引 言 固体废弃物堆肥过程需要对产生的抗生素的抗性基因进行检测,本文件的制定为企业测定堆肥中抗生素抗性基因的浓度提供依据。全国团体标准信息平台T/HBJC 00320201 畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法 1 范围 本文件规定了畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法。本文件适用于四环素类（tetM、tetQ、tetS、tetW、tetO、tetX、tetA、tetG、tetH）、磺胺类（sul1、sul2、sul3）、氯霉素类（cmlA、floR、fexA、cfr、fexB）、大环内酯类（ermQ、ermX、ermF）、喹诺酮类（gyrA）抗性基因的测定。本文件的CT值40。堆肥样品中抗生素抗性基因含量应大于500 拷贝数/g。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析试验用水规规和试验方法 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 好氧堆肥依靠专性和兼性好氧微生物的作用，使有机有机废弃物降解的堆肥过程。3.2 抗性基因指畜禽粪便废弃物堆肥中，微生物在抗生素选择压力的作用下发生基因突变，并产生大量ARGs。4 原理 使用实时定量分析仪（qPCR）对堆肥过程中抗生素抗性基因检测，根据不同抗生素抗性基因类型，使用不同引物对其进行扩增，获取其DNA片段，再与标记有荧光素的Taqman探针进行混合，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律。与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，抗性基因在特定光激发下发出荧光。经堆肥处理后的抗性基因含量与未经堆肥处理的抗性基因进行比较，以抗性基因拷贝数为最终检测指标。5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1 水：GB/T 6682，一级。全国团体标准信息平台T/HBJC 00320202 5.2 基因组 DNA 提取试剂盒。5.3 氯仿。5.4 异丙醇。5.5 无水乙醇。5.6 焦碳酸二乙酯水（DEPC）。5.7 0.45m 一次性聚四氟乙烯（PTFE）微孔滤膜。5.8 荧光定量 PCR 试剂 SYBR Green Mix。5.9 50 mg/mL EDTA。6 仪器和设备 6.1 实时荧光定量 PCR 仪。6.2 高速冷冻离心机。6.3 恒温水浴锅。6.4 生物安全柜。6.5 涡旋仪。6.6 微量可调移液器及配套带滤吸头。6.7 荧光 PCR 管及管盖。6.8 1.5mL EP 管。6.9 冰箱。7 样品 针对于不同规模堆肥厂中堆肥初期及堆肥腐熟后产品中抗生素抗性基因进行检测。针对不同堆体规模规格的畜禽粪便废弃物堆肥，按照四等分法进行堆肥样品采集。取样后应立即置于液氮或低温取样盒中，及时进行抗生素抗性基因检测。若不能及时检测，应将堆肥样品于-20保存直至分析。在取样过程中所有使用的工具在每次使用后都需高压灭菌或用75%的乙醇清洗。8 检测方法 8.1 样品总 DNA 提取 堆肥样品中抗生素抗性基因含量应大于500 拷贝数/g。本文件对抗生素含量提取及测定具体步骤如下：a)取 3g 堆肥样品置于 50mL 离心管中，向其中加入 10mL 脱腐缓冲液、10mLPBS 缓冲液；b)涡旋混匀后 1000rpm 离心 10min；c)缓慢将上清液转移到新的 50mL 离心管中，向原离心管中再次加入 10 mL 脱腐缓冲液、10 mLPBS 缓冲液；d)涡旋混匀后再次 1000rpm 离心 10min；e)将两次获得的上清液合并。将合并后的上清液 10000rpm 离心 5min，弃上清，得到脱腐后的堆肥样品；f)接下来采用 Omega 土壤 DNA 提取试剂盒对经脱腐后的堆肥样品进行 DNA 提取；全国团体标准信息平台T/HBJC 00320203 g)用 1%琼脂糖凝胶电泳对 DNA 提取效果进行检测，运用微量分光光度计对 DNA 的 OD260 和OD280 进行测定，OD260/OD280 比值应在 1.61.8；h)将提取的 DNA 储存于-20C 冰箱中。8.2 抗性基因标准曲线绘制 抗性基因标准曲线绘制按下列步骤：a)获取目的基因片段：用附表 A.1 中所列的 ARGs 引物对目的基因片段进行 PCR 扩增，模板为堆肥样品的总 DNA，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行验证；b)将 PCR 产物进行胶回收纯化；c)将胶回收产物连接到 PMD18-T 载体上，将连接产物转入 E.coli DH5感受态细胞；d)蓝白斑筛选阳性克隆子并分离纯化，进行测序验证；e)从阳性克隆子中提取重组质粒，再次对重组质粒进行 PCR 验证；f)计算质粒拷贝数（copies），质粒拷贝数/L DNA=(c6.021014)/(L660)，其中，c 为重组质粒的浓度，L 为重组质粒的大小（pMD18-T 载体大小+目的基因片段大小，bp）；g)质粒梯度稀释：根据以上计算的拷贝数，将质粒依次进行 10 倍梯度稀释，最终稀释为 7 个浓度梯度，稀释剂为超纯水（DEPC）；h)绘制标准曲线：以稀释好的质粒为 DNA 模板，进行荧光定量 PCR 扩增，查看扩增曲线和融解曲线确认扩增效果良好。以 CT 值为横坐标，log（copies）为纵坐标，建立一元线性方程，得到的标准曲线需满足 R2 0.99，扩增效率为（90110）%。将满足条件的标准曲线小份分装，置于-20C 冰箱中保存。8.3 抗性基因荧光定量 PCR 为保证体系的一致性，按照100个20L反应体系所需试剂配制无DNA模板的反应混合液，混匀后在0.1mL96 孔板的每个孔中分装18L混合液（2ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10l；Primer1(10M)4l；Primer2(10M)4l），然后加2L DNA模板，阴性对照加入2L DEPC水代替DNA模板，每个样品设置三个重复。反应程序为：a)预变性：95C 保持 30s；b)40 个循环扩增：95C 保持 10s，退火 30s；c)溶解曲线检测：95C 保持 15s，60C 保持 60s，95C 保持 15s；d)根据反应 CT 值带入标准曲线计算出未知样品中目的基因的浓度（copies/L DNA）。9 试验数据处理 利用分光光度计测定质粒标准品的浓度，根据公式计算拷贝数，按公示（1）计算：(1)式中：N 质粒拷贝数，单位拷贝数/ml；C 质粒浓度，单位g/ml；B 碱基数；660 每个碱基的分子量，单位为道尔顿（Da）；6.021023每摩尔DNA所拷贝的次数，单位次拷贝数/mol。全国团体标准信息平台T/HBJC 00320204 10 检测结果与分析 以牛粪，猪粪以及鸡粪堆肥为例分别进行为期40天的堆肥，利用荧光定量PCR仪，检测出堆肥过程中常见的四环素类抗生素抗性基因（tetG、tetH、tetQ、tetW、tetX）的丰度，检测结果如图1所示：图1 不同畜禽粪便堆肥过程中抗生素抗性基因丰度变化 11 质量保证与质量控制 质量保证与质量控制按下列步骤进行：a)在进行实时定量 PCR 时，确保提取的抗性基因的浓度足够高；b)绘制标准曲线时，回归系数应大于 0.995，不少于 4 个取样点，扩增效率为（90110）%；c)进行实时定量测定时，尽量选用一次性 96 孔板，保证每种抗性基因的纯度，对每个孔中的抗性基因进行标记，记录原始记录中，切记混合使用；d)在提取抗性基因并检测抗性基因时，应该有一个空白对照，每个处理应该有 3 个重复实验，减少实验误差，其误差值应在（0.010.1）%之间；e)提取抗性基因之后，应该及时上机进行检测；f)在提取抗性基因时，尽量全程在无菌的环境中进行。全国团体标准信息平台T/HBJC 00320205 A A 附 录 A（规范性附录）原始采集数据格式参考 A.1 实时荧光定量 PCR 引物设计畜禽粪便废弃物堆肥样品检测步骤中实时荧光定量 PCR 引物设计。表 A.1 实时荧光定量 PCR 引物设计 类型 基因 上下游 序列（53）四环素类 tetM FW ACAGAAAGCTTATTATATAAC RW TGGCGTGTCTATGATGTTCAC tetQ FW AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG RW CGGAGTGTCAATGATATTGCA tetS FW GAAAGCTTACTATACAGTAGC RW AGGAGTATCTACAATATTTAC tetW FW GAGAGCCTGCTATATGCCAGC RW GGGCGTATCCACAATGTTAAC tetO FW ACGGARAGTTTATTGTATACC RW TGGCGTATCTATAATGTTGAC tetX FW AGC CTT ACC AAT GGG TGT AAA RW TTC TTA CCT TGG ACA TCC CG tetA FW GCGCGATCTGGTTCACTCG RW AGTCGACAGYRGCGCCGGC tetG FW GCTCGGTGGTATCTCTGCTC RW AGCAACAGAATCGGGAACAC tetH FW CAA CCC ATT ACG GTG TGC TA RW AAG TGT GGT TGA GAA TGC CA 磺胺类 sul1 FW CGCACCGGAAACATCGCTGCAC RW TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG sul2 FW TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG RW CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG sul3 FW TCCGTTCAGCGAATTGGTGCAG RW TTCGTTCACGCCTTACACCAGC 氯霉素类 cmlA FW GCCAGCAGTGCCGTTTAT RW GGCCACCTCCCAGTAGAA floR FW CGGTCGGTATTGTCTTCACG RW TCACGGGCCACGCTGTAT fexA FW ATTCTCCCGCAAATAACG 全国团体标准信息平台T/HBJC 00320206 RW TCGGCTCAGTAGCATCACG cfr FW TGTGCTACAGGCAACATTGGAT RW CAAATACTTGACGGTTGGCTAGAG fexB FW CCCGATAGATAATAATACAG RW CACCAATAGTGGGAAGAT 喹诺酮类 gyrA FW CGATGTCGGTCATTGTTGGC RW ATACCTACG