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细胞工程主要技术细胞工程主要技术 2 动物细胞工程动物细胞工程主要主要技术技术 第一章第一章 动物细胞转化（诱变）动物细胞转化（诱变）第二章第二章 细胞融合技术细胞融合技术 第三章第三章 哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术 第四章第四章 哺乳动物胚胎培养与移植哺乳动物胚胎培养与移植 利用杂交瘤制备单克隆抗体技术利用杂交瘤制备单克隆抗体技术 干细胞技术干细胞技术 3 第一章第一章 动物细胞的转化（诱变）动物细胞的转化（诱变）通过细胞培养通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株世界上已建立了大量细胞株，我国业已我国业已建立了上百个细胞株建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献为细胞生物学和医学做出了重大贡献。正常组织的初级培养物正常组织的初级培养物，在传代培养过程中在传代培养过程中，细胞的寿细胞的寿命有一定的限度命有一定的限度，只有只有癌细胞癌细胞和和发生转化的细胞发生转化的细胞才能无限增才能无限增殖下去殖下去。所谓所谓转化即是即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而成为具有癌特性的细胞而成为具有癌特性的细胞。4 建立无限细胞系的关键建立无限细胞系的关键就是要就是要千方百计千方百计地使培养细胞发生转化地使培养细胞发生转化，即用某种因子刺激即用某种因子刺激正常细胞发生突变而具有癌特性正常细胞发生突变而具有癌特性。目前目前，使正常培养细胞发生转化的使正常培养细胞发生转化的刺激刺激因子因子主要有主要有三大类三大类：物理因子物理因子、化学因子和化学因子和生物因子生物因子。5（一）物理因子（一）物理因子 能使培养细胞发生转化的能使培养细胞发生转化的物理因子主要是指物理因子主要是指一些电离辐射：一些电离辐射：放射性同位素的射线：放射性同位素的射线：6060CoCo、1414C C、131131I I、3232P P、3 3H H X X 射线射线 紫外线照射紫外线照射 物物理理致致癌癌剂剂 6（二）化学因子（二）化学因子 对细胞具有转化作用的对细胞具有转化作用的化学因子达数千种之多，化学因子达数千种之多，其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。无机物：砷砷、石棉石棉、铬化合物铬化合物、镍化合物镍化合物、镉化镉化合物合物 有机物：苯苯、联苯胺联苯胺、杂环烃杂环烃、煤焦油煤焦油、黄曲霉黄曲霉素素(aflatoxin)、亚硝胺亚硝胺、烟碱烟碱(nicotine)化化学学致致癌癌剂剂 7（三）生物因子（三）生物因子 对细胞具有转化作用的生物因子为对细胞具有转化作用的生物因子为肿瘤病毒肿瘤病毒(tumor virus)，又 称又 称 致 癌 病 毒致 癌 病 毒(oncogenic virus)。现已发现有许多种病毒可引起动物或植物发现已发现有许多种病毒可引起动物或植物发生肿瘤生肿瘤。肿瘤病毒中有肿瘤病毒中有DNA病毒病毒，也有也有RNA病病毒毒。8 RousRous肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)：一种一种RNA病毒病毒，其基因组含有一个其基因组含有一个癌基因癌基因src，编码产编码产物为具有物为具有蛋白质激酶活性的蛋白质激酶活性的pp60src蛋白蛋白，可使许可使许多蛋白质磷酸化多蛋白质磷酸化，通过级联反应通过级联反应，诱发细胞癌变诱发细胞癌变。pp60src蛋白蛋白是一种膜蛋白是一种膜蛋白，结合在质膜的内结合在质膜的内表面表面，它它可催化磷酸根转移到一些蛋白质可催化磷酸根转移到一些蛋白质的酪氨的酪氨酸残基酸残基上上，使磷酸使磷酸化酪氨酸在化酪氨酸在细胞中的含量提高细胞中的含量提高了了10倍倍。9(Src蛋白蛋白,Tyr激酶激酶)P Tyr 蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化 细胞癌变细胞癌变 无活性无活性 pp60src RSV病毒中病毒中v-src基因的致癌机制图解基因的致癌机制图解 质膜质膜 跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白 细胞外配体细胞外配体 活性活性pp60src 质膜质膜 跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白 磷酸磷酸化酪氨酸两种化酪氨酸两种作用：作用：一是使细胞的正常调节一是使细胞的正常调节机制失调机制失调,细胞增殖失细胞增殖失去控制；去控制；二是使细胞的粘着性丧二是使细胞的粘着性丧失失,易发生扩散和转移。易发生扩散和转移。10 虽然虽然动物细胞动物细胞在培养皿在培养皿、培养瓶培养瓶、培养板中均可生培养板中均可生长长，但但在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌和酵母那样容易和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一是动物细胞培养的技术难题之一。目前这一问题已经解决目前这一问题已经解决，人们在微生物培养用的发人们在微生物培养用的发酵罐的基础上研制出一种用于酵罐的基础上研制出一种用于哺乳动物细胞培养的反应哺乳动物细胞培养的反应罐罐，用以大量培养悬浮细胞用以大量培养悬浮细胞（1个振动搅拌器：可以使个振动搅拌器：可以使细胞得到充足的营养和氧气细胞得到充足的营养和氧气）。转化动物细胞的规模化培养转化动物细胞的规模化培养 11 细 胞 融 合细 胞 融 合(Cell fusion)又 称 为 细 胞 杂 交又 称 为 细 胞 杂 交(Cell hybridization)，现多统称为细胞杂交现多统称为细胞杂交，是是指指2个或个或2个以个以上的细胞融合成上的细胞融合成1个细胞的过程个细胞的过程。人工的细胞融合开始于人工的细胞融合开始于1950s，此后作为一门新兴技此后作为一门新兴技术发展非常快术发展非常快，应用范围也极为广泛应用范围也极为广泛，不仅同种类细胞间不仅同种类细胞间可以融合可以融合，种间远缘细胞也能融合种间远缘细胞也能融合。细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的。第二章第二章 细胞融合技术细胞融合技术 12 细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而而且在生产实践上还有重要的应用价值且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单如目前在单克隆抗体的制备克隆抗体的制备、核质关系核质关系、体细胞的遗传和发育体细胞的遗传和发育、新品种的培养新品种的培养、免疫作用免疫作用、疾病的治疗和性状的改疾病的治疗和性状的改良良、潜伏病毒的研究等潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩已取得了显著的成绩。其中最突出的就是在制备其中最突出的就是在制备单克隆抗体单克隆抗体方面的应用方面的应用！13 根据所用促融剂的不同根据所用促融剂的不同，细胞融合技术主要可细胞融合技术主要可分为四大类：分为四大类：病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术 化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术 电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术 激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术 14 一、病毒介导的细胞融合技术一、病毒介导的细胞融合技术 促融剂：促融剂：麻疹病毒麻疹病毒、副流感病毒副流感病毒、新城鸡新城鸡瘟病毒瘟病毒、仙台病毒以及其他一些副粘液科仙台病毒以及其他一些副粘液科的病毒的病毒 基本原理：基本原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白蛋白(fusion protein),既可介导病毒同宿主细既可介导病毒同宿主细胞融合胞融合,又可诱导细胞与细胞融合又可诱导细胞与细胞融合。操作繁琐；操作繁琐；促融效果较好促融效果较好 15 融合蛋白融合蛋白是副粘病毒的两种包膜糖蛋白之一是副粘病毒的两种包膜糖蛋白之一，其其主要功能是引起病毒包膜与靶细胞膜或被感染主要功能是引起病毒包膜与靶细胞膜或被感染的靶细胞膜之间发生融合的靶细胞膜之间发生融合。细胞融合过程细胞融合过程需要另一种包膜糖蛋白需要另一种包膜糖蛋白血血凝素凝素-神经氨酸酶的协助神经氨酸酶的协助。融合蛋白需要和同源融合蛋白需要和同源性血凝素性血凝素-神经氨酸酶共同表达才能显示出融合神经氨酸酶共同表达才能显示出融合细胞的活性细胞的活性。16 病毒病毒 增殖增殖 紫外线灭活紫外线灭活 稀释稀释 细胞悬液细胞悬液 细胞融合细胞融合 诱导诱导 基本操作流程基本操作流程 筛选筛选 17 二、化学介导的细胞融合技术二、化学介导的细胞融合技术 聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)促融剂：促融剂：基本基本原理：原理：一般认为一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散疏散、进而使其结构发生重排进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质使两细胞的胞质沟通沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合从而造成相互接触的细胞之间发生融合。操作简便；操作简便；促融效果好促融效果好 18 诱导诱导 基本操作流程基本操作流程 A细胞细胞 融合细胞融合细胞 B细胞细胞 A/B细胞混合物细胞混合物 按一定数量比例混合按一定数量比例混合 与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀 一定温度、一定时间一定温度、一定时间 计数计数 筛选筛选 PEG配制：加热配制：加热溶化溶化，按体积比按体积比加入预热至加入预热至50oC的无血清培养基的无血清培养基后混匀后混匀，降温至降温至使用温度待用使用温度待用 PEG配制配制 PEG(MW1000-4000,4060%)19 促融效果与促融效果与PEG的分子量及其浓度成正比；的分子量及其浓度成正比；但但PEG分子量越大分子量越大、浓度越高浓度越高,对细胞的毒对细胞的毒性也就越大性也就越大（在实验时常常采用的分子量在实验时常常采用的分子量10004000的的PEG，浓度一般为浓度一般为4060%）PEG介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：1.PEG1.PEG分子量与浓度分子量与浓度:融合效果与温度成正比融合效果与温度成正比（质膜流动性与温度质膜流动性与温度成正比成正比），为获得最佳融合效果为获得最佳融合效果,在细胞可在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度能承受的温度范围内可适当提高处理的温度（哺乳动物细胞哺乳动物细胞，一般采用一般采用3840）2.PEG2.PEG的的pHpH值值:pH8.08.2：融合效果较好：融合效果较好 3.PEG3.PEG作用时间作用时间:处理时间越长处理时间越长，融合效果越好融合效果越好,但对细胞的但对细胞的毒害也就越大毒害也就越大（一般将处理时间限制在一般将处理时间限制在1min之内之内）4.4.融合温度融合温度:20 三、电击介导的细胞融合技术三、电击介导的细胞融合技术 操作简便、快速操作简便、快速/促促融效果好融效果好/高回收率高回收率/对细胞毒性小对细胞毒性小 原理：原理：游离动物细胞或去壁原生质体游离动物细胞或去壁原生质体，在电融合在电融合室中室中，在在高频交流电场的作用下高频交流电场的作用下，细胞被极化成细胞被极化成偶极子偶极子，造成细胞间相互连接成点接触状态；造成细胞间相互连接成点接触状态；然然后施加后施加方波脉冲予以刺激方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作由于电脉冲的瞬间作用用，可击破两细胞接触点处的质膜可击破两细胞接触点处的质膜，此时质膜的此时质膜的脂类分子发生重组脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作同时由于细胞表面的张力作用用，两个点接触细胞逐步发生细胞融合两个点接触细胞逐步发生细胞融合。BioRad电融合仪电融合仪 21 动物细胞动物细胞 0.6M甘露醇，甘露醇，0.5mM CaC12 2H20 80-300V/cm,0.5-1兆赫兹兆赫兹,30-90秒秒 0.5-1.5KV/cm,幅度脉宽幅度脉宽25微秒微秒 融合细胞融合细胞 诱导诱导 基本操作流程基本操作流程 筛选筛选 电击液电击液 悬浮于悬浮于 融合小室的电极间融合小室的电极间 加入至加入至 细胞排列成串细胞排列成串 电泳效应电泳效应 正弦交变电场正弦交变电场 施加施加 2-3个脉冲电场