TGDPPS 005-2022 烟粉虱传双生病毒病诊断技术规程.pdf

ICS 65.020.01B 16团体标准T/GDPPS 005-2022烟粉虱传双生病毒病诊断技术规程The Technical Code of Practice for Diagnostic Technique of DiseasesCaused by Whitefly-transmitted Geminiviruses2022-05-25 发布2022-05-25 实施广东省植物保护学会发 布全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-2022I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由广东省植物保护学会提出并归口。本文件起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点实验室。本文件主要起草人：汤亚飞、何自福、李正刚、佘小漫、于琳、蓝国兵。全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20221烟粉虱传双生病毒病诊断技术规程1范围本文件规定了烟粉虱传双生病毒病的术语和定义、田间诊断、实验室诊断、结果判定等技术要求。本文件适用于番茄、黄秋葵、南瓜、甘薯、烟草烟粉虱传双生病毒病诊断。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1烟粉虱传双生病毒 Whitefly-transmitted geminiviruses，WTGs烟粉虱传双生病毒，属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒，是一类植物单链环状DNA病毒，由烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久方式传播，同时可经嫁接传播，不能经机械摩擦或种子传播。根据基因组类型，烟粉虱传双生病毒可分为双组分病毒和单组分病毒。双组分病毒含有2 个大小为2.53.0 kb的单链环状DNA分子（分别称为DNA-A和DNA-B）；单组分病毒含有1个大小为2.53.0 kb的单链环状DNA分子，常伴随一些大小约为1.41.5kb的卫星分子。2.2烟粉虱传双生病毒病 Disease caused by whitefly-transmitted geminiviruses由烟粉虱传双生病毒侵染引起的一类植物病害，田间主要表现植物叶片黄化、卷曲、黄脉、叶缘黄化、花叶、叶脉深绿色、产生耳突、植株矮化等特征症状。2.3病害诊断 Disease diagnosis通过田间观察植株症状表现，进一步在实验室对病原物进行鉴定，根据两者的结果进行综合分析，做出诊断结论。3烟粉虱传双生病毒病田间诊断3.1烟粉虱传番茄双生病毒病田间诊断烟粉虱传番茄双生病毒病的田间症状：病株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶质变硬；植株若生长早期被感染，矮缩严重，无法正常开花结果；生长后期被感染植株上部叶和新芽表现症状，结果数减少，果实变小，成熟期果全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20222实着色不均匀（参见资料性附录A图1）。若田间番茄表现上述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定可能存在烟粉虱传双生病毒病的发生。3.2烟粉虱传黄秋葵双生病毒病田间诊断烟粉虱传黄秋葵双生病毒病的田间症状：病株叶片向上或向下卷曲、叶片正面出现网络状黄色或褪绿条纹，叶背面叶脉肿大突起，叶质脆硬；病株幼叶症状明显、叶小且卷曲，而老叶症状不明显或不表现症状。植株若早期被感染，明显矮化、叶小、叶脉肿大、结实数少且果实细小（参见资料性附录A图2）。若田间黄秋葵表现上述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发生。3.3烟粉虱传南瓜双生病毒病田间诊断烟粉虱传南瓜双生病毒病的田间症状：病株叶片卷曲，严重时叶背产生许多叶状增生物。早期感染会导致植株严重矮缩，不能正常开花结瓜（附录A图3）。若田间南瓜表现上述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发生。3.4烟粉虱传甘薯双生病毒病田间诊断烟粉虱传甘薯双生病毒病的田间症状：病株叶片卷曲、皱缩，叶脉黄化及植株矮缩（参见资料性附录A图4）。若田间甘薯表现上述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发生。3.5烟粉虱传烟草双生病毒病田间诊断烟粉虱传烟草双生病毒病的田间症状：病株叶片卷曲、皱缩，叶脉深绿色、肿大，严重时叶背产生叶耳，植株矮缩（参见资料性附录A图5）。若田间烟草表现上述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发生。4烟粉虱传双生病毒病实验室诊断4.1主要仪器设备高速台式冷冻离心机、植物组织匀浆器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、超低温冰箱、恒温水浴锅等。4.2主要试剂全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20223市售植物总DNA抽提试剂盒，普通PCR预混液，单链DNA滚环扩增试剂盒，2000 bpDNA 分子量标准，5000 bp DNA 分子量标准，BamH I、EcoR I、Hind III 限制性内切酶，T4-DNA连接酶等。4.3病样总 DNA 抽提分别取病株、健康植物的叶片各100 mg，按照植物总DNA提取试剂盒说明书抽提总DNA，DNA沉淀溶解于50 L 灭菌水中，直接使用或保存于-20 冰箱备用。4.4病毒 PCR 检测4.4.1PCR 扩增利用检测烟粉虱传双生病毒的通用引物AV494（5-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3）和CoPR（5-GANGSATGHGTRCADGCCATATA-3）（Y=C/T、R=/G、M=A/C、N=A/C/G/T、S=C/G、H=A/C/T）疑似病样总DNA进行PCR检测。反应体系为：植物总DNA 1.0 L（约20 ng），灭菌水12.0 L，市售商品化的普通2PCR预混液15.0 L，10 mol/L引物AV494 1.0 L，10 mol/L 引物CoPR 1.0 L，总体积为30.0 L。将上述反应混合液按照以下步骤进行PCR扩增，94 预变性 4 min；94 变性 45 s，52 退火 45 s，72 延伸 45 s，35个循环完成后，72 延伸 10 min结束反应，4 保存。加5L PCR产物在1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，毎板留一个加样孔加5 L DL 2000 DNA分子量标准，在电压120 V下进行电泳30 min，最后在紫外凝胶成像系统观察结果。4.4.2结果判定选取室内接种烟粉虱传双生病毒的显症植株为阳性对照，当阳性对照能扩增出570 bp的特异性条带、健康对照和空白对照无扩增条带时，若待检样品能扩增出570 bp条带，可判定为阳性，也即该病样感染了烟粉虱传双生病毒；当待检样品无特异性扩增条带，判为阴性，即该样品未感染烟粉虱传双生病毒（附录B）。4.5病毒全基因组序列的获得4.5.1滚环扩增 Rolling circle amplification technique（RCA）利用市售单链DNA 滚环扩增试剂盒对5.4检测为阳性的代表性病样总DNA进行滚环扩增，方法按照试剂盒说明书上的步骤进行。具体为：首先取1.0 L（约20 ng）病样总DNA加入灭菌的PCR管中，随后加入到5.0 L样品缓冲液中，95 变性3 min，立即置冰上冷却，加入5.0 L反应缓冲液和0.2 L DNA聚合酶，30 恒温反应18 h20 h，最后65 加热10min使酶失活终止反应，所获产物直接用于后续酶切鉴定，也可-20 长期保存。4.5.2滚环扩增产物酶切鉴定全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20224上述所获滚环扩增产物分别用BamH I，EcoR I，Hind III等限制性内切酶进行酶切。若滚环扩增产物被酶切出2.73.0 kb条带（附录C），则推测其可能是病毒基因组A或B组分的全长；若切出1.4 kb左右的条带（附录C），则推测其可能是伴随病毒的卫星分子全长。进一步对酶切产物进行克隆、测序。4.5.3PCR 扩增针对通用引物PCR检测阳性而RCA产物未切出的条带、田间症状典型的病样，进一步根据570 bp片段测序，设计一对背向特异引物来扩增DNA-A全长；利用扩增卫星分子全长的通用引物扩增伴随的卫星分子全长。4.6病毒种类确定测定的序列经DNAStar软件SeqMan拼接后获得病毒全基因组序列，然后在GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中利用BLASTn程序进行序列相似性搜索，进一步用SDT1.2的MUSCLE进行序列相似性比较分析，最后依据国际双生病毒分类标准来确定病毒种类。目前双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒种的最新分类标准为，所获病毒DNA-A序列与全部已知病毒相似性94%时，判定为该已知病毒的分离物。全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20225附录A（资料性附录）烟粉虱传双生病毒病田间症状图A.1 烟粉虱传番茄双生病毒病图A.2 烟粉虱传黄秋葵双生病毒病图A.3 烟粉虱传南瓜双生病毒病全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20226图A.4 烟粉虱传甘薯双生病毒病图A.5 烟粉虱传烟草双生病毒病全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20227附录B（资料性附录）烟粉虱传双生病毒 PCR 检测结果电泳图图6 疑似病样滚环扩增产物的酶切电泳结果M：2000bp DNA 分子量标准；泳道 1-4：疑似病样（示为检测阳性）；泳道 5：阳性对照（室内接种烟粉虱传双生病毒的显症植株）；泳道 6：阴性对照（健康植株）；泳道 7：空白对照（清水）。全国团体标准信息平台T/GDPPS 005-20228附 录 C（资料性附录）疑似病样滚环扩增产物的酶切电泳结果图7 疑似病样滚环扩增产物的酶切电泳结果M：5000bp DNA 分子量标准；泳道 1-3、6-7、12-13、15-17、23：示烟粉虱传双生病毒基因组 A 或 B；泳道 9、21-23：示烟粉虱传双生病毒基因组 A 或 B 及卫星分子；泳道 4-5、8、11、14、18、22：为空泳道_全国团体标准信息平台