TCVMA 40-2020 乙型脑炎病毒微滴式数字RT-PCR检测方法.pdf

团体标准 T/CVMA 40-2020 乙型脑炎病毒微滴式数字 RT-PCR 检测方法 Method of droplet digital RT-PCR for detection of Japanese encephalitis virus 2020-12-22 发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 ICS 11.220 B 41 中国兽医协会CVMAT/CVMA 40-2020 1 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国兽医协会提出并归口。本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：李鑫、王建、赵洪进、鞠厚斌、葛菲菲、杨德全、沈海潇、杨显超、刘健、陶田谷晟。中国兽医协会CVMAT/CVMA 40-2020 2 乙型脑炎病毒微滴式数字 RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）微滴式数字RT-PCR检测的操作方法。本文件适用于猪脑组织、血液样本中乙型脑炎病毒感染及疫苗免疫核酸的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。数字 RT-PCR：数字反转录聚合酶链式反应（digital reverse transcript polymerase chain reaction）BHQ1：无荧光淬灭基团（black hole quencher-1）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）5 原理 微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。本文件通过特异性引物和探针进行数字RT-PCR扩增，从而对乙型脑炎病毒核酸进行检测。6 试剂与材料 6.1 引物和探针 上游引物（JEV F）：5-ACCAAGAAGTCTACGTCCAATATGG-3 下游引物（JEV R）：5-TTGGACCGACACGGATCTC-3 中国兽医协会CVMAT/CVMA 40-2020 3 探针（JEV P）：5-FAM-TGCACGCGGACCAGGCATTC-BHQ1-3 6.2 核酸提取试剂 选取针对提取病毒 RNA 的提取试剂盒，或等效的其他 RNA 提取试剂。6.3 数字 RT-PCR 反应试剂 按照不同的微滴式数字 PCR 平台的说明书选取其推荐的数字 RT-PCR 反应试剂盒，或等效的其他反应试剂。7 仪器与设备 7.1 级生物安全柜。7.2 微滴式数字 PCR 平台。7.3 纯水仪。7.4 高速冷冻离心机。7.5 组织研磨器。7.6 涡旋震荡仪。8 操作步骤 8.1 样品采集及运输 采集濒死动物、扑杀动物或流产胎儿脑组织，或待检活动物血液等，具体要求按照NY/T 541执行。8.2 样品处理 8.2.1 脑组织 取适量待检脑组织，按1:10体积加入PBS，置于组织研磨器中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻融3次，10000 r/min离心5 min，取上清液至无菌离心管中。8.2.2 血液 将采集的血液以2500 r/min离心5 min，分离出血清至无菌离心管中。8.3 RNA 提取 按照所选取的病毒RNA提取试剂盒说明书进行提取，或其他等效的RNA提取方法。8.4 微滴式数字 RT-PCR 扩增方法 8.4.1 微滴式数字 RT-PCR 体系配制 微滴式数字 RT-PCR 扩增体系配制按表 1 所示。该步骤按照不同品牌微滴式数字 PCR 平台的说明书进行操作。中国兽医协会CVMAT/CVMA 40-2020 4 表 1 微滴式数字 RT-PCR 扩增体系 试剂 终浓度 体积 酶混合液a/8 L JEV F+R（10 mol/L）0.9 mol/L 1.8 L JEV P（10 mol/L）0.25 mol/L 0.5 L RNA 模板/2 L 无核酸酶水/7.7 L 总体系/20 L 注：使用微滴式数字 PCR 平台进行实验时，应依据不同微滴式数字 PCR 平台调整扩增体系的组分和最终体积，表中所列组分的终浓度不变。a 微滴式数字 RT-PCR 扩增试剂。8.4.2 微滴生成、数字 RT-PCR 扩增及结果读取 反应液配制后，使用微滴发生器对扩增体系进行微滴生成。微滴生成后，进行微滴式数字 RT-PCR扩增。荧光分析步骤采用 FAM 单荧光通道，微滴式数字 RT-PCR 扩增程序按表 2 所示。表 2 微滴式数字 RT-PCR 扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 50 20 min 1 2 95 10 min 1 3 95 30 s 40 4 55 1 min 5 98 10 min 1 6 12 60 min 1 注：升降温速率设置为 2.5/s。8.5 微滴式数字 RT-PCR 反应的对照 在进行微滴式数字RT-PCR实验时，应设置阳性对照、阴性对照与空白对照。用含有乙型脑炎病毒的RNA作为阳性对照；用未感染乙型脑炎病毒动物的组织混样基因组作为阴性对照；用无核酸酶水作为空白对照。各对照RT-PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和RT-PCR扩增程序与8.4.1和8.4.2相同。9 结果分析 9.1 实验成立条件 微滴式数字RT-PCR扩增结果，有效微滴数不得低于理论微滴数的60%。阴性对照和空白对照均未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴，且核酸拷贝数浓度10 拷贝/L，则实验成立。9.2 阈值设定 微滴式数字RT-PCR结果中，阳性微滴和阴性微滴明显分开，阈值设在阳性微滴和阴性微滴分开的区域。中国兽医协会CVMAT/CVMA 40-2020 5 9.3 结果判定 9.3.1 阴性 样品中未检出阳性微滴，则判定为阴性。9.3.2 阳性 样品中检测出阳性微滴，且阳性核酸拷贝数浓度3 拷贝/L，则判定为阳性。9.3.3 有效原则 样品中检测出阳性微滴，阳性核酸拷贝数浓度3 拷贝/L，则需复检。若复检结果仍检测出阳性微滴，则判定为阳性，否则判定为阴性。10 生物安全要求 检测过程中涉及的生物安全要求按照GB 19489 实验室生物安全通用要求的规定执行。_ 中国兽医协会CVMA