TCVMA 21-2020 动物源性细菌药物敏感性试验肉汤稀释法.pdf

ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 212020 动物源性细菌药物敏感性试验 肉汤稀释法 Drug sensitivity test for animal-derived bacteria-broth dilution method 2020-12-22 发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 I 目 次 前言.III 动物源性细菌药物敏感性试验 肉汤稀释法.1 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义、符号和缩略语.1 4 试剂与材料.2 5 器械与耗材.2 6 培养基的确定.2 7 抗菌药物的确定.3 8 菌株确定.3 8.1 质控菌株.3 8.2 病原菌株.3 8.2.1 病原菌株选择的要求.3 8.2.2 病原菌株选择的操作要求.3 9 药物敏感性试验.3 9.1 宏量肉汤稀释法（试管法).3 9.1.1 抗菌药物的制备和储存稀释.3 9.1.2 待测菌株的制备和接种.4 9.2 微量肉汤稀释法.4 9.2.1 抗菌药物的制备和储存稀释.4 9.2.2 待测菌株的制备和接种.4 10 培养方法.4 11 结果判定.4 附录 A（规范性）.6 A.1 MHB 培养基.6 A.2 营养琼脂培养基.6 A.3 药物储备液.6 A.4 药物工作液.6 附录 B（规范性）.7 药物敏感性试验质控菌株的允许范围（第 1 页/共 2 页）.7 药物敏感性试验质控菌株的允许范围（第 2 页/共 2 页）.8 附录 C（资料性）.9 金黄色葡萄球菌药物敏感性试验判定标准和限制值(第 1 页/共 2 页).9 金黄色葡萄球菌药物敏感性试验判定标准和限制值（第 2 页/共 2 页）.10 附录 D（资料性）.11 链球菌药物敏感性试验判定标准和限制值(第 1 页/共 2 页).11 链球菌药物敏感性试验判定标准和限制值(第 2 页/共 2 页).12 附录 E（资料性）.13 肠杆菌药物敏感性试验判定标准和限制值(第 1 页/共 2 页).13 肠杆菌药物敏感性试验判定标准和限制值（第 2 页/共 2 页）.14 附录 F（资料性）.15 巴氏杆菌药物敏感性试验判定标准和限制值(第 1 页/共 2 页).15 中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 II 巴氏杆菌药物敏感性试验判定标准和限制值（第 2 页/共 2 页）.16 中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中国兽医协会提出并归口。本文件起草单位：吉林大学动物医学学院。本文件主要起草人：于录、王超、安雅男、王雪飞、栾文静、徐红月、李树林。中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 1 动物源性细菌药物敏感性试验 肉汤稀释法 1 范围 本文件规定了兽医实验室对动物源性细菌进行药物敏感性试验的术语和定义与缩略语、试剂与耗材、器械与设备、培养基的确定、抗菌药物的确定、菌株确定、药物敏感性试验、培养方法、结果判定的要求。本文件适应于动物源性细菌的肉汤稀释法药物敏感性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY 5030 无公害食品畜禽饲养兽药使用准则 3 术语和定义、符号和缩略语 以下术语和定义适用于本文件。3.1 敏感 susceptible，S 指细菌被抑制的抗微生物药物浓度。3.2 中介 intermediate，I 介于敏感和耐药间的抗微生物药物浓度范围。3.3 耐药 resistant，R 指按常规剂量表，在抗微生物药通常可达到的浓度时，菌株不能被抑制；或/和表明抑菌圈直径缩小到菌株可能产生了微生物耐药机制的范围内。3.4 最低抑菌浓度 minimal inhibition concentration，MIC 在体外实验中，药物能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度。3.5 中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 2 质量保证 quality assurance，QA 质量管理的一部分，保证质量要求得到满足。3.6 美国典型培养物收藏中心 American Type Culture Collection，ATCC 是国际公认的细菌保藏权威机构。3.7 美国临床和实验室标准协会 Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI 抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准制定协会。4 试剂与材料 4.1 MHB 肉汤 Mueller-hintot Broth，MHB，符合附录 A.1 的规定。4.2 水，符合 GB/T 6682 二级水的要求。4.3 营养琼脂培养基，符合附录 A.2 的规定。4.4 二甲基亚砜分析纯，99%。4.5 无水甲醇分析纯，99.9%。4.6 药物储备液，符合附录 A.3 的规定。4.7 药物工作液，符合附录 A.4 的规定。5 器械与耗材 5.1 恒温培养箱 5.2 振荡培养箱 5.3 生物安全柜 5.4 超净工作台 5.5 分析天平，感量 0.1 mg 5.6 分光光度计 5.7 pH 酸度计 5.8 高压灭菌锅 5.9 三角烧瓶，250 mL 5.10 96 孔微量稀释板 5.11 微量移液器，0.1 L2.5 L，0.5 L10 L，1 L100 L，100 L1000 L 5.12 八道移液器，50 L300 L 5.13 枪头，10 L，200 L，1000 L 5.14 平皿(90 mm)5.15 称量托盘 5.16 试管（13 mm 100 mm），冷冻试管（12.5 mm 48 mm）5.17 容量瓶，100 mL 6 培养基的确定 中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 3 普通分离快速生长的需氧菌或兼性厌氧菌敏感性试验应使用 MHB 培养基。7 抗菌药物的确定 根据相关兽药管理条例、NY 5030，选择适用于兽药敏感性试验的抗菌药物。8 菌株确定 8.1 质控菌株 选择质控菌株时，应同时满足以下要求：质控菌株应从 ATCC 获得；使用稳定的质控菌株，选择满足最小化维持抗微生物剂的质控菌株数量；在检测特定菌株时，质量控制的质控菌株应符合附录 B 的规定；常规质控菌株应每周进行药敏测试，为确保测试结果准确，应淘汰不合格质控菌株。上述过程应符合 GB/T 27401。8.2 病原菌株 8.2.1 病原菌株选择的要求 8.2.1.1 应对被选择的菌株进行敏感性试验。8.2.1.2 当病原菌出现耐药性时，应进行敏感性试验。8.2.1.3 对青霉素敏感的菌株，应进行红霉素或其他大环内酯类药物的敏感性试验。8.2.1.4 已确定为敏感的菌株，不必进行敏感性试验。8.2.2 病原菌株选择的操作要求 8.2.2.1 送检的待测菌株在营养琼脂平皿上于 33 37 恒温培养箱培养 16 h24 h，选择符合被检菌特性的细菌进行敏感性试验。8.2.2.2 对送检病料先进行纯化培养，再进行敏感性试验。9 药物敏感性试验 9.1 宏量肉汤稀释法（试管法)9.1.1 抗菌药物的制备和储存稀释 9.1.1.1 采用无菌试管（5.16）进行试验。如果后续试验需要冷冻保存，应用冷冻试管。9.1.1.2 使用分析天平称量药物时，应避免药剂依附到实验室器具上（5.15）。9.1.1.3 在氧气存在下失活的药物，应采用现用现配的培养基进行稀释。9.1.1.4 试管口应封闭，防止液体流出。9.1.1.5 制备的抗菌药物应进行二倍比稀释。9.1.1.6 制备的抗菌药物试管，当天使用；不立即使用的试管，置于-20 以下（最好是-60 以下）保存备用；特殊药物（如克拉维酸、亚胺培南、卡那霉素，氨苄青霉素等），应储存于-60 以下；融化后的药物溶液应立即使用，不宜再次冻存。9.1.1.7 上述每一步试验均应设对照组。中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 4 9.1.2 待测菌株的制备和接种 9.1.2.1 将质控菌株与待测菌株分别接种于营养琼脂平板并置于 33 37 恒温培养箱培养8 h12 h；挑取单个典型菌落接种于 2 mL 无菌营养肉汤中于 33 37 振荡培养箱中培养5 h6 h。9.1.2.2 将上述培养物采用麦氏法和显微镜法进行细菌计数。9.1.2.3 用生理盐水稀释至终浓度 5105 CFU/mL 备用，此操作应在 15 min 内完成。9.1.2.4 在每一含 1 mL 的抗菌药物的系列稀释试管中分别加入 1 mL 校正的质控菌株与待测菌株，并混匀。9.1.2.5 应同时将菌悬液接种至其非选择性琼脂平皿培养中，以检查接种菌悬液的纯度（90%），以上操作规范应符合 GB 19489。9.2 微量肉汤稀释法 9.2.1 抗菌药物的制备和储存稀释 9.2.1.1 对选定的抗菌药物配制成 10 倍浓度的储备液；具体操作时，将储备液进行 10 倍稀释成工作液。9.2.1.2 将工作液加入 96 孔微量稀释板第一列，每孔加入 0.18 mL0.22 mL；其余各列加入空白的 MHB 肉汤，每孔加入 0.08 mL0.12 mL。9.2.1.3 用八道移液器逐级二倍比稀释。9.2.1.4 制备的抗菌药物稀释板，当天使用；不立即使用，应用塑料袋封闭，置于-20 以下（最好是-60 以下）保存备用；特殊药物（如克拉维酸、亚胺培南、卡那霉素，氨苄青霉素等），应储存于-60 以下；融化后的药物溶液应立即使用，不再次冻存。9.2.1.5 上述每一步试验均应设对照组。9.2.2 待测菌株的制备和接种 9.2.2.1 将质控菌株与待测菌株分别接种于营养琼脂平板并置于 33 37 恒温培养箱培养8 h12 h；挑取单个典型菌落接种于 2 mL 无菌营养肉汤中于 33 37 振荡培养箱中培养5 h6 h。9.2.2.2 将上述培养物采用麦氏法和显微镜法进行细菌计数。9.2.2.3 用生理盐水稀释至终浓度 5105 CFU/mL 备用，此操作应在 15 min 内完成。9.2.2.4 在每一含 100 L 的抗菌药物的系列稀释试管中分别加入 100 L 校正的质控菌株与待测菌株，并混匀。9.1.2.5 应同时将菌悬液接种至其非选择性琼脂平皿培养中，以检查接种菌悬液的纯度（90%）。10 培养方法 对微量肉汤稀释法与宏量肉汤稀释法进行孵育时，置于 33 37 恒温培养箱孵育 16 h24 h。11 结果判定 11.1 对试管或微量稀释板进行肉眼观察，所见最后一个清亮孔的抗菌药物浓度即为 MIC 值。11.2 结果若存在一个跳孔现象，应读最高的 MIC；多个跳孔时不能报告结果。中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 5 11.3 金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠埃希氏菌ATCC25922、肺炎链球菌ATCC49619作为质控菌株，相应的耐药、中介、敏感值应符合附录 B 的规定。11.4 革兰氏阴性杆菌微量稀释法与宏量稀释法的 MIC 值相同，或相差 1 个倍比稀释度。11.5 每次稀释试验可能存在误差，上下一个倍比稀释度不影响结果判定。11.6 金黄色葡萄球菌、链球菌、肠杆菌、巴氏杆菌的药物敏感性试验判定标准和限制值分别可参见附录 C、附录 D、附录 E、附录 F。中国兽医协会CVMAT/CVMA 21-2020 6 附 录 A（规范性）相关试剂的配制 A.1 MHB 培养基 准确称取牛肉粉2.0 g，可溶性淀粉1.5 g，酸水解酪蛋白17.5 g，量取1000 mL纯化水，使用搅拌器搅拌使其完全溶解，使用pH酸度计测定pH值（pH要求