ICS11.220B41团体标准T/CVMA25-2020口蹄疫病毒O型、A型和Asia1型分型荧光RT-PCR检测方法Real-timeRT-PCRfordetectionoffootandmouthdiseasevirusserotypeO,AandAsia12020-12-22发布2020-12-22实施中国兽医协会发布中国兽医协会CVMAT/CVMA25-2020I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中国兽医协会提出并归口。本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、中国动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：刘湘涛、何继军、林密、马维民、杨光、杨亚民、高鹏程、靳野、郑海学、郭建宏、王传彬、刘玉良中国兽医协会CVMAT/CVMA25-20201口蹄疫病毒O型、A型和Asia1型分型荧光RT-PCR检测方法1范围本文件规定了口蹄疫病毒O型、A型和Asia1型分型荧光RT-PCR检测方法的试剂、主要仪器设备、操作步骤、结果判定和注意事项。本文件适用于疑似口蹄疫临床发病动物水泡皮、水泡液、反刍动物食道-咽部分泌物（O-P液）、动物组织和病毒培养物中口蹄疫病毒核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18935口蹄疫诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂4.1总RNA提取试剂4.1.1无核酸酶水：将焦碳酸二乙酯（DEPC）按0.1%的量（w/v）加入三蒸水中制备的无DNA酶和RNA酶水（按照附录A.1配制）。宜使用商品化无核酸酶水。4.1.2Trizol裂解液：商品化试剂，4℃保存。4.1.3三氯甲烷：分析纯，常温保存。4.1.4异丙醇：分析纯，常温保存。使用前预冷至-20℃。4.1.575%乙醇：无水乙醇（分析纯）与无核酸酶水按体积比3:1配制而成。使用前预冷至-20℃。4.1.6其他商品化RNA提取试剂：可采用其他商品化RNA提取方法，如采用离心柱、磁珠法、自动化核酸提取仪等提取RNA，分别使用配套试剂。4.2Real-timeRT-PCR试剂2×一步RT-PCR缓冲液、聚合酶ExTaqHS(5U/µL)、PrimeScript反转录酶混合液、RNA酶抑制剂（40U/µL）。4.3引物和探针序列中国兽医协会CVMAT/CVMA25-20202O型上游引物序列为：5’-GCTCTTTCCCCACCAGTTCA-3’；下游引物序列为：5’-TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA-3’；探针序列为：5’-CGGACGAACATGACGGCGCACA-3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ。A型上游引物序列为：5’-TTG...
