TCVMA 13-2018 H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 132018 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光 RT-PCR 检测方法 Duplex real-time RT-PCR assay for detection of avian influenza A(H7N9)virus 2018-10-24 发布 2018-10-24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 132018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心 本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。T/CVMA 132018 1 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 RNA 提取试剂 RNA提取试剂详见附录A.1A.4，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.2 5 RT-PCR 缓冲液 Tris base 15.14 g KCl 13.98 g MgCl2.6H2O 1.53 g DTT 3.86 g 加无核酸酶灭菌蒸馏水至 400 mL，调 pH 值至 8.3（室温下），定容至 500 mL。过滤（0.22 m）除菌后置于 28保存备用。3.3.10 PCR缓冲液的配制 Tris base 6.06 g KCl 18.64 g Triton X-100 5.00 mL 加无核酸酶灭菌蒸馏水至400 mL，用HCl调pH值至9.0（室温下），定容至500 mL。高压灭菌冷却后置于28保存备用。3.3 引物和探针 T/CVMA 132018 2 表1 所用引物和探针 3.4 其他试剂 Taq DNA聚合酶（5U/L）、AMV反转录酶（10U/L）、RNA酶抑制剂（40 U/L）、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。4 仪器设备 分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20冰箱、可调移液器。5 操作步骤 5.1 样品采集 样品采集按照NY/T 541进行。对于病死禽，取脑、肺、气管、喉头等组织；对于活禽，用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少量泄殖腔粪便，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）的同一离心管中，加盖，编号。5.2 样品处理 5.2.1 组织样品 每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1 g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入1.0 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，10,000 g 离心2 min，取上清液100 L于1.5 mL灭菌离心管中。5.2.2 分泌物和排泄物样品 名称 序列（5-3）目的基因 HA-7-F TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCAT HA HA-7-R ACAAATAGTGCACYGCATGTTTCC HA-7-P FAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGB NA-9-F ACACTCAAACGGAACAATACACG NA NA-9-R GACCACCCAATGCATTCCAC NA-9-P HEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB 注 1：将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至 10 pmol/L 后使用。注 2：引物序列中，R 代表 A 或 G 碱基；Y 代表 C 或 T 碱基 T/CVMA 132018 3 将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合，捻动、挤压干后弃去拭子。10,000 g离心5 min，吸取上清100 L于1.5 mL灭菌离心管中。5.2.3 培养物样品 将培养物10,000 g离心5 min，取上清100 L于1.5 mL灭菌离心管中。5.3 病毒 RNA 的提取 5.3.1 若选用附录 A 中所列试剂提取病毒 RNA，则参照以下步骤进行操作：a)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600 L，充分颠倒混匀，室温静置 3 min5 min；b)将液体吸入吸附柱中，10,000 g 离心 30 s；c)弃去收集管中液体，加入 600 L 洗涤液，10,000 g 离心 30 s；d)重复上述步骤 c）进行洗涤；e)弃去收集管中液体，10,000 g 离心 2 min，以除去残留的洗涤液；f)将吸附柱移入新的 1.5 mL 无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 L，室温静置 1 min，10,000 g 离心 30 s，离心管中液体为模板 RNA。5.3.2 若使用病毒 RNA 试剂盒提取病毒 RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4 双重实时荧光 RT-PCR 扩增 按照表2配制双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系。表2 双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系 项目 试剂 体积 HA 引物和探针 HA-7-F 0.80 L HA-7-R 0.80 L HA-7-P 0.80 L NA 引物和探针 NA-7-F 0.80 L NA-7-R 0.80 L NA-7-P 0.80 L PCR 反应溶液 无核酸酶灭菌蒸馏水 3.60 L 5 RT-PCR 缓冲液 4.00 L 10 PCR 缓冲液 2.00 L AMV 反转录酶 0.25 L RNA 酶抑制剂 0.15 L Taq DNA 聚合酶 0.20 L RNA 模板 5.00 L 总体积 20.0 L 注：如仅需扩增 HA 或 NA 基因，则选择表中扩增该基因的相应引物和探针以及 PCR 反应溶液配制反应体系，同时增加无菌核酸酶灭菌蒸馏水至 6.00 L。T/CVMA 132018 4 将表2中试剂加到荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。扩增HA基因的荧光报告基团为FAM，扩增NA的为HEX（如果仪器未经HEX校正过，可用VIC代替），淬灭基团为BHQ或MGB。在荧光PCR仪上按表3所示程序进行扩增反应。表3 荧光RT-PCR扩增程序 5.5 荧光 RT-PCR 反应对照 吸取含灭活的H7N9亚型禽流感病毒的鸡胚尿囊液100 L至1.5 mL灭菌离心管中，作为阳性对照；吸取SPF鸡胚尿囊液100 L至1.5 mL灭菌离心管中，作为阴性对照。各对照RT-PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和RT-PCR扩增程序与5.4相同。5.6 结果分析 5.6.1 实验成立条件 阳性对照Ct值30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无典型的扩增曲线，实验结果成立，实例可参考附录B.1。5.6.2 阈值设定 阈值线设定于刚刚超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。5.6.3 结果判定 若被检样品FAM荧光信号Ct值30并出现典型的扩增曲线，则判为H7阳性，实例可参考附录B.2；若被检样品HEX荧光信号Ct值30并出现典型的扩增曲线，则判为N9阳性，实例可参考附录B.3；若被检样品30Ct35并出现典型的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品Ct值35时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，判为阴性。步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 30 min 1 2 94 3 min 1 3 94 15 s 40 4 53 10 s 5 60 30 s 注：在每个循环第二步（60）延伸时收集荧光信号。T/CVMA 132018 5 附 录 A(规范性附录)试剂的配制 A.1 保护液（50%生理盐水）将生理盐水缓慢倒入盛有甘油的容器中，按 1:1 体积比充分混合。A.2 裂解液 异硫氰酸胍 236.4 g 氯化钠 23.2 g 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA）（pH=8.0）40 mL 灭菌双蒸水 加至 2000 mL EDTA（0.5 mol/L,pH=8.0）溶液配制）溶液配制 EDTA 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0（室温下）灭菌双蒸水 加至 100 mL A.3 洗涤液 磷酸氢二钠 143.2g 磷酸二氢钾 62.4g 氯化钠 18g 灭菌双蒸水 加至 2000 mL 再加入 6000mL 无水乙醇，充分混匀。A.4 洗脱液 磷酸氢二钠 143.2 g 磷酸二氢钾 62.4 g 灭菌双蒸水 加至 2000 mL T/CVMA 132018 6 附 录 B（资料性附录）荧光 RT-PCR 扩增实例参照 B.1 H7N9 荧光 RT-PCR 扩增阳性 B.2 H7(HA)荧光 RT-PCR 扩增阳性 B.3 N9(NA)荧光 RT-PCR 扩增阳性 H7 阴性对照 N9 阴性对照 H7 N9 阴性对照 T/CVMA 132018 7