TZNZ 088-2021 水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药敏试验方法.pdf

ICS 07.100.99 CCS B41 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T/ZNZ 0882021 水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药敏试验方法 Isolation and antimicrobial susceptibility testing of Riemerella anatipestifer from waterfowl 2021-10-28 发布 2021-11-28 实施 浙江省农产品质量安全学会 发 布 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所、浙江国伟科技有限公司、金华金婺农业发展有限公司、山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：唐标、杨华、朱寅初、陈斌丹、马剑钢、吴静、冯伟峰、刘玉庆、张存、王小骊、卢立志、汪建妹、肖英平、汪雯、黄学涛、肖兴宁、曾涛、黄雨婷。全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 1 水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药敏试验方法 1 范围 本文件规定了水禽鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）的分离及药敏试验方法中的设备和材料、培养基、试剂和参考菌株、试验程序、分离纯化、确证、微量肉汤稀释法药敏试验及生物安全的要求。本文件适用于水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药敏实验。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.9 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB 4789.11 食品安全国家标准 食品微生物学检验 型溶血性链球菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求 DB37/T 3880 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 T/ZNZ 044 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 CLSI M100 ED30 美国临床实验室标准化委员会抗微生物药敏试验标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鸭疫里默氏杆菌 Riemerella anatipestifer 黄杆菌科，里氏杆菌属；革兰氏染色阴性，瑞氏染色可见两极着色；菌体呈杆状或椭圆形，多为单个散在，部分成双或短链状排列，可形成荚膜，无芽孢，无鞭毛；该菌血清型众多，临床主要感染包括鸭、鹅等水禽，致病致死能力强。3.2 药敏试验 antimicrobial susceptibility testing 检测微生物（本文件特指细菌）对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的体外敏感性，以指导临全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 2 床合理选用药物的微生物学试验。3.3 最低抑菌浓度 Minimal inhibitory concentration，MIC 在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。4 设备和材料 4.1 设备 开展细菌耐药性监测微生物实验室应符合 GB 19489 生物安全二级实验室（BSL-2）要求，灭菌、培养和鉴定设备按 GB 4789.1 和 GB 4789.9 执行，其他设备如下：微量移液器：0.1 L2.5 L、1 L10 L、10 L100 L；100 L1 000 L；电子天平：感量 0.001 g；自动加样仪或多通道微量加样器：10 L100 L；二氧化碳培养箱：提供 5%10%二氧化碳条件、36 1；冰箱：2 8、20、80；麦氏比浊管和浊度仪：可测量范围：0.01 麦氏单位4.00 麦氏单位；核酸电泳仪；凝胶成像系统；聚合酶链式反应（PCR）扩增仪；微生物生化鉴定系统：含生化鉴定卡；质谱鉴定仪：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，含常见病原菌数据库。4.2 材料 需要用到的相关实验材料如下：无菌培养皿：直径 60 mm、90 mm；96 孔透明无菌微孔板：每孔体积超过 100 L；1 L 一次性无菌接种环、10 L 一次性无菌接种环；无菌采集袋、无菌棉棒、标准比浊管、冰袋；生化鉴定试剂盒；商品化药敏试验板。5 培养基、试剂和参考菌株 5.1 实验用水 培养基制备用水应符合 GB 4789.28，试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的规定。5.2 培养基 5.2.1 胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone soybean broth,TSB）培养基：按 GB 4789.11 执行。5.2.2 5%绵羊血 TSB 琼脂平板及其制备按附录 A 中表 A.1 执行。5.3 试剂 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 3 5.3.1 细菌基因组提取试剂盒。5.3.2 鸭疫里默氏杆菌特异性 PCR 扩增引物按照 DB37/T 3880 执行。5.3.3 PCR 扩增试剂盒。5.3.4 瑞氏染色液的制备按附录 A 中表 A.2 执行。5.3.5 3%过氧化氢（H2O2）溶液的制备按 GB 4789.11 执行。5.3.6 磷酸盐缓冲液（PBS）制备按 GB 4789.28 执行。5.3.7 革兰氏染色液的制备按 GB 4789.11 执行。5.4 参考菌株 5.4.1 药敏试验质控菌株 药敏试验板质控菌株使用大肠埃希菌 ATCC 25922。5.4.2 阳性对照菌株 阳性对照菌株使用鸭疫里默氏杆菌 ATCC 11845。6 试验程序 水禽鸭疫里默氏杆菌分离及药敏试验程序如图1所示。图1 鸭疫里默氏杆菌分离及药敏试验程序 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 4 7 分离纯化 7.1 样品 7.1.1 采集 采集具典型临床症状（纤维素性渗出、心包炎、肝周炎等）的发病或死亡水禽的血液、心包积液、肝、脾、脑等组织。7.1.2 保存 样品采集后应密封保存，并加注样品标识，采样记录和样品编码应详尽。样品的保存应按照GB 4789.1的要求执行。7.1.3 运输 采集的样品按GB 4789.1要求运达检验单位，运输时间不超过 24 h，运输工具应保持清洁，运输和装卸过程中应防止包装破损，样品渗漏。7.1.4 接收 样品运至实验室时，应确认样品完好情况。7.2 分离 采用平板划线法。用无菌接种环深入组织内部或接触血液、组织（液），于 5%绵羊血 TSB 琼脂平板上分区划线，置 36 1、含 5%10%CO2 的二氧化碳培养箱中培养 24 h48 h。7.3 纯化 鸭疫里默氏杆菌在 5%绵羊血 TSB 琼脂平板上可形成约 1 mm2 mm 的灰白色圆形隆起菌落，表面光滑，边缘整齐，大多不溶血。根据观察菌落形态，挑取可疑单菌落应用革兰氏染色和瑞氏染色染色后镜检结果应符合鸭疫里默氏杆菌病原学的基本特征。取染色观察后疑似单菌落进行平板划线，平置 36 1、含 5%10%CO2 的二氧化碳培养箱中培养 24 h48 h，从平板上挑取单菌落 3 个5 个，分别转移至 2 mL3 mL 含 5%马血清的 TSB 增菌液，36 1 条件下，使用 200 rpm 转速振荡培养 24 h48 h，TSB 培养物呈现上下均一浑浊。使用无菌接种环蘸取培养物划线接种 5%绵羊血 TSB 血平板，于 36 1、含 5%10%CO2 的二氧化碳培养箱中培养 24 h48 h，备用。8 确证 8.1 PCR 法 8.1.1 DNA 提取 将 7.3 中纯化后保存备用的鸭疫里默氏杆菌可疑菌落在 5%绵羊血 TSB 琼脂平板上活化，参照 DB37/T 3880，挑取单菌落用采用煮沸法提取 DNA，或使用细菌基因组提取试剂盒提取 DNA。8.1.2 扩增 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 5 通过鸭疫里默氏杆菌特异性确证引物进行 PCR 扩增，引物序列、反应体系和程序按照 DB37/T 3880 的要求执行。8.1.3 判定 PCR 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳观察，鸭疫里默氏杆菌应扩增出 475 bp 条带，判别方法按DB37/T 3880 的要求执行。8.2 生化法 使用微生物生化鉴定系统，将待检测菌液加入生化鉴定卡，反应后读取生化特征信息，根据鉴定系统生成细菌鉴定结果。使用生化鉴定试剂盒时，具体操作方法和判定应参照生化鉴定试剂盒使用说明书。8.3 质谱法 按T/ZNZ 044执行。8.4 菌株保藏 将确证后的菌落经含 5%马血清TSB培养液增殖，4 000 rpm离心 2 min，弃培养基，重新加入含25%甘油的TSB培养液重悬菌体，80 条件下保藏。9 微量肉汤稀释法药敏试验 9.1 细菌培养 测试菌株和质控菌株在测试前应连续培养 2 次以尽可能获得活化的纯培养物，培养方法按 7.3 执行。9.2 药敏板准备 使用商品化药敏试验板时，按照药敏板说明书进行操作，若MIC范围符合美国临床和实验室标准协会（CLSI M100）标准则认为药敏试验板有效。9.3 菌悬液制备 挑取活化后的 3 个5 个单菌落一起转移至含 2 mL3 mL 无菌生理盐水或 TSB 的试管中混匀，用浊度仪和标准比浊管校正菌液浓度至 0.5 麦氏单位（1108 CFU/mL），用无菌 TSB 肉汤（含 5%马血清）稀释 100 倍，混匀备用，制备的菌悬液应在 15 min 内完成加样。9.4 菌悬液加样 每块药敏试验板需设置阴性孔和阳性孔。阴性孔中加入无菌 TSB（含 5%马血清）100 L，阳性孔（不含抗菌药物）中加入制备好的 100 L 菌悬液，其余孔（含不同梯度的抗菌药物）各加入制备菌悬液 100 L，盖上无菌盖并标记菌株编号和时间等信息。9.5 孵育 加样完成后培养 20 h24 h，培养条件按 7.3 执行。9.6 质控 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 6 同一批次药敏试验应设置质控菌株的对照，菌悬液的制备、加样与孵育按T/ZNZ 044执行。鸭疫里默氏杆菌阳性菌株药敏试验步骤分别按9.3、9.4、9.5执行。9.7 结果判定 9.7.1 结果观察 取出药敏板，在光线良好条件下用肉眼观察结果。以肉眼可见抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC。9.7.2 结果记录 9.7.2.1 如阴性孔未见浑浊且阳性孔浑浊，则该药敏试验板结果有效，可进行 MIC 结果的判读；若出现单个跳孔现象，判读方法按照 WS/T 639 执行；出现两个以上跳孔现象的，则该次药敏试验无效，需重新检测。9.7.2.2 质控菌株判读结果在 MIC 质控范围内、阳性对照菌在药敏板上生长良好则认为该次药敏试验有效。9.7.2.3 在 9.7.2.1 和 9.7.2.2 同时有效的前提下，可进行测试菌株的 MIC 统计，并按附录 B 记录。10 生物安全 10.1 开展细菌分离与药敏试验等实验室管理应符合 GB 4789.1、GB 19489 生物安全要求。10.2 废弃物处理应严格按照 GB 19489 的要求执行。10.3 菌株管理按照中华人民共和国农业农村部令第 16 号文件中动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法相关规定执行。全国团体标准信息平台T/ZNZ 0882021 7 附 录 A（规范性）培养基的成分和配制方法 A.1 5%绵羊血TSB琼脂平板 A.1.1 成分 绵羊血TSB琼脂平板成分见表A.1。表 A.1 绵羊血 TSB 琼脂平板成分 组分，单位 用量 胰蛋白胨大豆肉汤，mL 950.0 琼脂粉，g 15.0 无菌脱纤维绵羊血，mL 50.0 A.1.2 制法 胰蛋白胨大豆肉