TZNZ 044-2020 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 43 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T/ZNZ 0442020 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 Method for antibacterial resistance surveillance in livestock and poultry breeding 2020-12-08 发布 2021-01-08 实施 浙江省农产品质量安全学会 发 布 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所。本文件主要起草人：杨华、唐标、王小骊、钱鸣蓉、吉小凤、吕文涛、肖英平、汪建妹、谈思敏、吴静、汪雯、肖兴宁、吴俐勤、李锐。全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 1 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 1 范围 本文件规定了畜禽养殖环节细菌耐药性监测的设备和材料、试剂和培养基、样品采集与保存、细菌分离鉴定与保存、抗菌药物敏感性试验、生物安全的要求。本文件适用于畜禽源的大肠埃希氏菌、肠球菌和弯曲杆菌分离鉴定，及其抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.9 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 4789.38 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2206.5 化妆品微生物检验方法第5部分：肠球菌 YY/T 1169 麦康凯琼脂培养基 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 细菌耐药性 antibacterial resistance 细菌耐药性是指细菌对抗菌药物不敏感的现象。3.2 抗菌药物敏感性试验 antibacterial susceptibility testing 用于测试抗菌药物在体外对细菌有无抑制或杀灭作用的标准化试验，简称药敏试验。3.3 最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration，MIC 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 2 体外能够抑制肉眼可见的细菌生长的最低药物浓度。3.4 折点 breakpoint 用于判定测试菌株敏感（Susceptible）、中敏（Intermediate，I）和耐药（Resistant，R）的最低抑菌浓度。4 设备和材料 开展细菌耐药性监测微生物实验室应符合 GB 19489 生物安全二级实验室（BSL-2）要求，灭菌、培养和鉴定设备按 GB 4789.1 和 GB 4789.9 执行，其他设备如下：微量移液器：0.1 L2.5 L；0.5 L10 L；10 L100 L；100 L1 000 L；电子天平：感量 0.01 g，感量 0.00 001 g；自动加样仪或多通道微量加样器：1 L100 L；厌氧培养罐；麦氏比浊管和浊度仪：可测量范围麦氏浊度0.014.00；核酸电泳仪；凝胶成像系统；PCR 扩增仪；质谱鉴定仪：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，含常见病原菌数据库。5 试剂和培养基 5.1 实验用水 实验用水应符合 GB/T 6682 和 GB 4789.28 的规定。5.2 无菌生理盐水 称取 0.9 g 氯化钠溶于 100 mL 蒸馏水中，121灭菌 15 min。5.3 抗菌药物 抗菌药物贮备液和工作液的制备与保存见附录 A。5.4 培养基 5.4.1 运送培养基的制备按 GB 4789.28 执行。5.4.2 缓冲蛋白胨水的制备按 GB4789.4 执行。5.4.3 大肠埃希氏菌显色培养基(伊红美蓝琼脂培养基)的制备按 GB 4789.38 执行。5.4.4 大肠埃希氏菌显色培养基(麦康凯琼脂培养基)的制备按 YY/T 1169 执行。5.4.5 肠球菌显色培养基的制备按 SN/T 2206.5 执行。5.4.6 LB 琼脂培养基的制备按附录 B.1 执行。5.4.7 Bolton 肉汤（Bolton broth）的制备按 GB 4789.9 执行。5.4.8 改良 CCDA 琼脂的制备按 GB 4789.9 执行。5.4.9 哥伦比亚血平板的制备按 GB 4789.9 执行。全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 3 5.4.10 布氏肉汤的制备按 GB 4789.9 执行。5.4.11 弯曲杆菌保藏液的制备按附录 B.2 执行。5.4.12 MH 肉汤（Mueller-Hinton broth）的制备按附录 B.3 执行。5.5 质控菌株 5.5.1 大肠埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC 25922）；5.5.2 粪肠球菌 ATCC 29212（Enterococcus faecalis，ATCC 29212）；5.5.3 空肠弯曲杆菌 ATCC 33560（Campylobacter jejuni，ATCC 33560）。注：质控菌株在-70 以下保存，传代不应超过 5 次。6 样品采集与保存 6.1 样品采集 6.1.1 直肠/泄殖腔拭子采集 用无菌生理盐水或运送培养基浸润灭菌棉拭子，伸入家畜直肠或家禽泄殖腔 1.5 cm2.0 cm，旋转2 圈3 圈，立即将棉拭子置于 10 mL 运送培养基中。6.1.2 新鲜粪便采集 用灭菌棉拭子蘸取新鲜粪便，不应沾有泥土或其他污染物，立即将棉拭子及样品置于 10 mL 运送培养基中。对用于弯曲杆菌分离的样品，应采集成团或成堆的新鲜粪便样本。6.1.3 盲肠内容物采集 用灭菌棉拭子蘸取盲肠内容物，立即置于 10 mL 运送培养基中。对用于弯曲杆菌分离的样品，宜在屠宰时截取一段内容物丰富的盲肠段，结扎后置于无菌密封袋。6.2 采样记录和标识 样品采集后应加盖密封，并加注样品标识，及时填写采样记录表。采样记录表和样品编码格式参见附录 C。6.3 样品保存 样品应置于28条件下保存，避免交叉污染。对用于弯曲杆菌分离的样品，保存过程应放置微需氧产气袋，以提高分离率。6.4 样品运输 采集的样品由专人保管，按GB 4789.1要求运达检验单位，运输时间不超过48 h。运输工具应保持清洁。运输和装卸过程中应防止包装破损，样品渗漏。6.5 样品接收 实验室接收样品时，应确认样品完好情况、数量，交接双方签字确认。样品应立即开展细菌分离。7 细菌分离鉴定与保存 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 4 7.1 细菌分离鉴定 7.1.1 大肠埃希氏菌分离鉴定按附录 D.1 执行。7.1.2 肠球菌分离鉴定按附录 D.2 执行。7.1.3 弯曲杆菌分离鉴定按附录 D.3 执行。7.1.4 大肠埃希氏菌、肠球菌、弯曲杆菌鉴定可参照附录 D.4 执行。7.2 分离菌株保存 分离菌株保存参照GB 4789.28执行。8 抗菌药物敏感性试验 8.1 细菌培养 测试菌株和质控菌株在测试前应分别连续培养 2 次以获得纯培养物，培养方法按附录 D 执行。8.2 药敏板准备 准备96孔透明无菌微孔板，每孔加样体积应超过100 L。用MH肉汤（弯曲杆菌药敏试验另加5%马血清）将抗菌药物贮备液稀释制备工作液，系列倍比稀释至测试浓度，测试浓度参考附录A，每孔50 L。分别各设置1个阴性对照孔和阳性对照孔。使用商品化试剂盒时，按照试剂盒说明书进行操作。8.3 菌悬液制备 挑取培养 12 h24 h 的单菌落 3 个5 个，转移至含 2 mL3 mL 无菌生理盐水或 MH 肉汤的试管中混匀，用浊度仪和标准比浊管校正菌液浓度至 0.5 麦氏单位（1108 CFU/mL），用 MH 肉汤稀释 100倍，混匀备用，调制好浓度的菌液应在 15 min 内完成加样。8.4 菌悬液接种 阴性对照孔中加入 MH 肉汤 100 L，阳性对照孔中加入制备好的待测菌液（用前混匀）和 MH 肉汤各 50 L，其余孔分别加入制备菌悬液 50 L，盖上无菌盖并标记菌株编号。8.5 孵育 大肠埃希氏菌和肠球菌加样完成后培养18 h20 h，弯曲杆菌培养20 h24 h，培养条件按附录D。8.6 质控 每批次药敏试验均应设置质控菌株的对照，操作方法同测试菌株。8.7 结果判定 8.7.1 结果观察 取出药敏板，在光线良好条件下用肉眼观察结果。以肉眼可见抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC。8.7.2 质量控制 全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 5 8.7.2.1 质控结果判读 质控菌株的 MIC 应符合附录 F 规定。如质控菌株 MIC 不在规定范围内，则本次试验结果无效。8.7.2.2 对照孔结果判读 如阴性对照孔未见浑浊且阳性对照孔浑浊，则该药敏板结果有效，可继续判读菌株 MIC，将结果填入附录 E。出现其他现象的，则该药敏板结果无效。8.7.2.3 结果判定 8.7.2.1 和 8.7.2.2 均有效时，待测菌株结果有效。在试验结果有效的前提下，继续判读测试菌株的MIC，判读完成后进行记录。8.8 耐药性结果 根据测试菌株的 MIC 值，按照附录 F 判定其耐药性，结果报告为敏感（S）、中敏（I）或耐药（R）。对于没有规定折点的药物，报告其 MIC 值。9 生物安全 开展细菌分离鉴定与药敏试验等实验室管理应符合 GB 4789.1、GB 19489 生物安全要求，废弃物处理应严格按照 GB 19489 规定执行。菌株管理按照动物病原微生物菌(毒)种保藏办理办法执行。全国团体标准信息平台T/ZNZ 0442020 6 附 录 A（规范性）抗菌药物贮备液和工作液的制备与保存 A.1 抗菌药物种类 A.1.1 监测大肠埃希氏菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、头孢噻呋、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、美罗培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹等 16 种抗菌药物的耐药性。A.1.2 监测肠球菌对青霉素、阿莫西林/克拉维酸、红霉素、克林霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻呋、头孢西丁、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、万古霉素、多西环素、氟苯尼考、苯唑西林、庆大霉素、泰妙菌素、替米考星、利奈唑胺等 18 种抗菌药物的耐药性。A.1.3 监测弯曲杆菌对阿奇霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素等 9 种抗菌药物的耐药性。A.2 抗菌药物贮备液的制备与保存 精密称定抗菌药物标准品或对照品适量，按照使用说明书加入一定量的溶剂制成最高测试浓度的 10 倍的贮备液，置-20以下保存。A.3 抗菌药物工作液的制备 测试的浓度范围取决于细菌的种类和抗菌药物，选择的范围应覆盖菌株的MIC终点。使用MH肉汤和对倍稀释法将抗菌药物制成0.03 g/mL至2 048 g/mL之间的梯度，具体浓度范围见表A.1。表A.1 抗菌药物浓度范围 单位：g/mL 大肠大肠埃希氏菌埃希氏菌 肠球菌肠球菌 弯曲杆菌弯曲杆菌 抗菌药物 稀释浓度范围 抗菌药物 稀释浓度范围 抗菌药物 稀释浓度范围 氨苄西林 5120.25 青霉素 2560.12 环丙沙星 640.03 阿莫西林-克拉维酸 512/2560.25/0.12 阿莫西林-克拉维酸 128/640.06/0.03 萘啶酸 1282 庆大霉素