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TSHZSAQS
015-2020
实时荧光定量PCR法高效检测绵羊多胎Fecb基因SNP位点技术规程
015
2020
实时
荧光
定量
PCR
高效
检测
绵羊
Fecb
基因
SNP
技术规程
ICS 67.120.20 B 40 团体标准 T/SHZSAQS 0152020 实时荧光定量PCR法高效检测绵羊多胎Fecb基因 SNP 位点技术规程 2020-12-26 发布 2020-12-31 实施 石河子市质量标准化协会 发 布 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 0152020 I 目 次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 3.1 多胎.1 3.2 Fecb.1 3.3 实时荧光定量 PCR 法.1 4 主要试剂配制.1 4.1 20 mg/mL 蛋白酶 K.2 4.2 柠檬酸钠(ACD)抗凝剂.2 4.3 1mol/L Tris.2 4.4 0.5M EDTA(pH8.0).2 4.5 TE(pH8.0).2 4.6 PBS.2 4.7 DNA 抽提缓冲液.2 5 检测方法.2 5.1 样本采集.2 5.2 DNA 提取.2 5.3 DNA 浓度和纯度测定.3 6 引物设计.3 7 实时荧光定量 PCR 法检测.3 7.1 实时荧光定量 PCR 法反应体系.3 7.2 实时荧光定量 PCR 法反应条件.3 8 Fecb基因 SNP 位点分型结果判断.3 附录 A(资料性附录)荧光定量法检测绵羊多胎 Fecb基因分型标准图谱.4 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 0152020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准附录 A 为资料性附录。本标准起草单位:新疆农垦科学院畜牧兽医研究所、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:徐梦思、甘尚权、杨鹏、储明星。全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 0152020 1 实时荧光定量 PCR 法高效检测绵羊多胎 Fecb基因 SNP 位点技术规程 1 范围 本规程规定了利用实时荧光定量 PCR 法检测绵羊多胎主效基因 Fecb的分子检测方法。本规程适用于绵羊多胎主效基因 Fecb的分子检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法 NY/T 1672-2008 绵羊多胎主效基因 Fecb分子检测技术规程 3 术语和定义 NY/T 1672-2008界定的术语和定义适用于本文件。3.1 多胎 指一次分娩产出两个或两个以上胎儿。3.2 Fecb Fecb是绵羊繁殖性状的主效基因之一,该主效基因被定位到绵羊6号染色体上,对应于人染色体4q22-23区间内的骨形态发生蛋白受体IB(bonc morphogcnctic protein receptor IB,bmpb-ib)。绵羊bmpb-ib基因高度保守区的胞内的A746G突变,导致所编码氨基酸的胞内激酶区域249位由谷氨酰胺(Q)变成精氨酸(R)。研究表明,该突变与绵羊的高繁殖力密切相关。Fecb即bmpb-ib基因的746G或249R,Fec+即bmpb-ib基因的746A或249Q。一个拷贝Fecb平均增加排卵数1.65个,增加产羔数0.91.2只;两个拷贝Fecb平均增加排卵数2.73.0个,增加产羔数1.11.7只。3.3 实时荧光定量 PCR 法 实时荧光定量 PCR 法是指对特定核苷酸片断进行指数级扩增的 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA 的起始浓度进行定量的方法。4 主要试剂配制 全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 0152020 2 4.1 20 mg/mL 蛋白酶 K 20 mg蛋白酶K溶于1 mL灭菌双蒸水,-20 保存。4.2 柠檬酸钠(ACD)抗凝剂 柠檬酸 0.48 g,柠檬酸钠 1.32 g,葡萄糖 1.47 g 定容于 100 mL 水中,高压灭菌 20 min。每6 mL 新鲜血液中加入 1 mL 的 ACD 抗凝剂。4.3 1mol/L Tris 121.1 g Tris 碱溶于 800 mL 蒸馏水中,加入浓 HCl 调节 pH 值至 8.0,加水定容至 1 L,分装后高压灭菌。4.4 0.5M EDTA(pH8.0)186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na.2H2O)溶于 800 mL 水中加入,在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用 NaOH 调节溶液 pH 至 8.0,然后定容至 1 L,高压灭菌。4.5 TE(pH8.0)1mol/L Tris.Cl(pH8.0)10 mL、0.5 mol/L EDTA(pH8.0)2 mL 加水定容至 1 L,高压灭菌。4.6 PBS 在 700 mL 水中溶解 NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 g,用 HCl 调节pH 至 7.4,,加水定容至 1 L,高压灭菌。4.7 DNA 抽提缓冲液 取 1 mol/L Tris.Cl 2.5 mL、0.5 M EDTA(pH8.0)50 mL、10%SDS 12.5 mL 加水定容至 250 mL,高压灭菌。5 检测方法 5.1 样本采集 每只绵羊颈静脉采血量为 10 mL,ACD 抗凝。采血后,颠倒混匀防治血液凝固,-20 冻存。5.2 DNA 提取 取 750 L 冻存血样加入等量 PBS,混合均匀,12,000 rpm 离心 5 分钟,弃上清;加入 450 L DNA 抽提 buffer,重悬沉淀;加入 RNase 至终浓度 20 g/mL,37 温育 1 小时;加入蛋白酶 K 至全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 0152020 3 终浓度 100 g/mL,混匀,55 水浴消化过夜;加入等体积 Tris 饱和酚,温和摇动 10 分钟,12000 rpm 离心 5 min;将上层水相转移至另一干净离心管中;再加入等体积的酚:氯仿和氯仿,各抽提一次;上层水相用 1/5 体积乙酸铵和 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA;12000 rpm 离心 10 min,收集沉淀,70%乙醇洗涤;真空抽干,用适量 TE(pH8.0)溶解 DNA。5.3 DNA 浓度和纯度测定 取 210 L 待测 DNA 溶液置入一新的微量离心管中,用蒸馏水稀释 100500 倍;在紫外分光光度计 260nm、280nm 处测定 OD 值。DNA 浓度(g/mL)=OD260 值 10;DNA 纯度=OD260/OD280。DNA 的纯品 OD260/OD280 比值为 1.8,若比值大于 1.8,则说明有 RNA 存在,若小于 1.8,则说明有蛋白质存在。6 引物设计 针对绵羊 bmpr-ib 基因高度保守的胞内激酶信号区域 A746G 突变设计特异引物,扩增产物大小为53bp。引 物 序 列 如 下,上 游 引 物:5-GCCAGCTGGTTCCGAGAG-3;下 游 引 物:5-TCATGCCTCATCAACACCGT-3。7 实时荧光定量 PCR 法检测 7.1 实时荧光定量 PCR 法反应体系 荧光定量法扩增反应总体积为 20 L,其中 SYB Green Mix 10 L,上下游引物(10mol/L)各 1 L,50 ng/L DNA 模板 1 L,去离子水 7L。7.2 实时荧光定量 PCR 法反应条件 荧光定量法反应条件如下:95 预变性 10 min;PCR 循环,95 变性 20 s,60 退火 30 s,72 延伸 10 s,共 45 个循环;72 延伸 5 min,每个样品重复 3 次。8 Fecb基因 SNP 位点分型结果判断 通过观察 qRT-PCR 扩增曲线进行 Fecb基因 SNP 位点分型,当扩增曲线稳定,聚集性好时可用于结果分析。具体分型依据如下图所示。观察溶解曲线温度,看对称轴温度值分布,78.5 为野生型纯合子 AA 型,79.2 为突变型杂合子 AG 型,79.9 为突变型纯合子 GG 型。三种型中 AA型比较好判断,AG 和 GG 可能存在带型比较接近的情况,此时可看中心对称轴温度,靠近 79 为AG 型,靠近 80 为 GG 型。全国团体标准信息平台T/SHZSAQS 0152020 4 附 录 A (资料性附录)荧光定量法检测绵羊多胎 Fecb基因分型标准图谱 全国团体标准信息平台