TSAIA 005-2021 绵羊痘和山羊痘荧光PCR检测方法.pdf

ICS 65.020.20 B 38 团团 体体 标标 准准 T/T/S SAIAAIA 00005 520202121 绵羊痘和山羊痘荧光 PCR 检测方法 Real-time PCR method for detection of sheep pox and goat pox 20212021-1212-2020 发布发布 2022021 1-1212-2020 实施实施 山东省农业产业化促进会 发发布布 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 前前 言言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本文件由山东省农业产业化标准委员会提出并归口。本文件起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司、滨州市农业技术推广中心、日照市东港区动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：王金良、沈志强、唐娜、孟卫芹、高青华、魏凤、刘通、许崇友、董林、于新友、陈金龙、姚春阳、陈士运、李振伟。全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 绵羊痘和山羊痘荧光绵羊痘和山羊痘荧光 PCR 检测方法检测方法 1 1 范围范围 本文件规定了绵羊痘和山羊痘荧光 PCR 检测的操作方法。本文件适用于绵羊痘和山羊痘核酸检测。2 2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 3 术语和定义术语和定义 下列缩略语适用于本文件。Ct 值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cycle Threshold）PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffer Solution）荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应（Real-time Polymerase Chain Reaction）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）4 4 仪器仪器设备设备 4.4.1 1 二级生物安全柜。4.24.2 荧光 PCR 检测仪。4.4.3 3 高速冷冻离心机：可控温至 4，离心速度可达 13 000g 以上。4.4.4 4 普通冰箱：冷藏 2 8、冷冻20。4.4.5 5 超低温冰箱：可控温至-70 以下。4.4.6 6 变速组织研磨器。4.4.7 7 单通道微量移液器：量程分别为 0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L。4.4.8 8 电子天平：精度为 0.01 g。4.4.9 9 涡旋振荡器。1 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 4.14.10 0 高压蒸汽灭菌器。5 5 试剂试剂 5 5.1 .1 除非另有说明外，本标准所用检测试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T6682 三级水的标准。5 5.2 2 无水乙醇：室温放置。5 5.3 3 75%乙醇：配制见附录 A.1，室温放置。5 5.4 4 PBS：配制见附录 A.2。5 5.5 5 引物和 TaqMan 探针：引物名称和序列见附录 B。5 5.6 6 阳性对照：市售山羊痘活疫苗株。5 5.7 7 阴性对照：无山羊痘病毒感染的组织。6 6 样品的采集、运输及处理样品的采集、运输及处理 6 6.1.1 采样注意事项采样注意事项 采样及样品处理过程中应戴一次性手套，样品间不得交叉污染。6 6.2 2 样品采集样品采集 6 6.2 2.1.1 病料病料样品采集样品采集 取发病活体羊的皮肤丘疹或病死剖检羊的肺、淋巴结等组织 5 g10 g，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号标记，置于样品冷藏箱送至实验室。在实验室生物安全柜内取出待检样品，加入5 倍体积 4 预冷的 PBS 中，充分研磨，4、3 000g 离心 10 min，取上清液转入离心管中编号备用。6 6.2 2.2 2 细胞培养物细胞培养物 取 1 mL 细胞培养物置于离心管内，反复冻融 3 次，4、3 000g 离心 10 min，取上清液转入离心管中编号备用。6 6.2.2.3 3 疫苗样品疫苗样品 随机抽取山羊痘活疫苗样品 3 瓶，分别加入 2 mL 的 PBS，溶解，混匀，4、3 000g 离心 10 min，取上清液转入离心管中编号备用。6 6.3 3 样品保存与运输样品保存与运输 采集样品在 2 8 条件下保存，时间应不超过 24 h；若需要长期保存，应放置-70 冰箱采 2 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 集的样品密封后，采用保温箱加冰密封，在 2 8 条件下 24 h 内运送到实验室。按兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7 7 荧光荧光 PCRPCR 操作程序操作程序 7 7.1.1 DNADNA 抽提抽提 7 7.1.1.1 1 按以下步骤完成 DNA 抽提或选取商品化的病毒 DNA 提取试剂盒进行 DNA 抽提。7 7.1.2.1.2 取 n 个灭菌 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品阳性对照阴性对照，对每个离心管进行编号。7 7.1.3.1.3 每管加入 750 L 的 DNAzol，再分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各 250 L，颠倒 5 次混匀，涡旋震荡 10 s，于 4 或室温 13 000 g 离心 10 min。7 7.1.1.4 4 取与本标准 7.1.2 中相同数量的灭菌 1.5 mL 离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准 7.1.3 中离心后的上清液 900 L 置于上述 1.5 mL 离心管中，加入 500 L 无水乙醇，混匀，室温放置3 min5 min；4 或室温 13 000 g 离心 5 min。7.1.5 7.1.5 弃上清，沿管壁缓缓加入 0.8 mL1 mL 75%乙醇，颠倒 2 次5 次混匀，室温放置 3 min5 min；4 或室温 13 000 g 离心 5 min。将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。7 7.1.6.1.6 每管加入30 L50L 的8 mmol/L NaOH水溶液溶解沉淀，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA，3 000 g 离心 10 s，2 7 7.2 2 荧光荧光 PCRPCR 检测检测 7 7.2.1.2.1 反应体系的配制反应体系的配制 设荧光 PCR反应管数为n，n为待检样品数阳性管数阴性管数，每个样本扩增反应体系配置见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n1个反应进行配制。7 7.2.2.2.2 反应液的分装反应液的分装 将7.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管18 L分装于PCR反应管内，按顺序加样并做好标识，分装时尽量避免产生气泡。7 7.2.3.2.3 加样加样 在各设定的荧光PCR管中加入本标准7.1制备的2 L DNA溶液，盖紧管盖后，混匀后瞬时离心。7 7.2.4.2.4 上上机检测机检测 将本标准7.2.3中离心后的PCR管放入荧光PCR仪内，记录样品摆放顺序，选择HEX检测通道。循环条件设置：第一阶段，95 预变性180 s；3 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 第二阶段，95 变性5 s，退火、延伸、荧光采集60 20 s，40个循环；第三阶段，冷却25 20 s。8 8 结果判定结果判定 8 8.1.1 结果分析条件设定结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8 8.2.2 质控标准质控标准 8 8.2.1.2.1 阴性对照：无 Ct 值，且无典型扩增曲线。8 8.2.2.2 2 阳性对照：Ct 值30.0，并出现典型的扩增曲线。8 8.2.3.2.3 8.2.1 和 8.2.2 要求需在同一次实验中同时满足，否则视为无效检验，需重新检测。8 8.3.3 结果描述及判定结果描述及判定 8 8.3.1.3.1 被检样本检测结果中 HEX 通道 Ct 值38，且扩增曲线为典型的 S 曲线，报告为羊痘病毒核酸阳性；38Ct 值40，判定为可疑，可疑样品重新检测，如重复后仍然 38Ct 值40，且扩增曲线均为典型的 S 曲线，报告为羊痘病毒核酸阳性。8 8.3.2.3.2 被检样本检测结果中HEX通道无Ct值或无典型的S型扩增曲线，报告为羊痘病毒核酸阴性。4 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 附录附录 A A （规范性附录）（规范性附录）相关试剂的配制相关试剂的配制 A.A.1 1 75%75%乙醇乙醇 取 75 mL 无水乙醇，加水至 100 mL，充分混匀后，保存备用。A.A.2 2 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L0.01 mol/L，p pH H=7.47.4）取 Na2HPO412H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8 g，溶于 800 mL 水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然后加水定容至 1 000 mL，121 高压灭菌 15 min，4 保存备用。5 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 附录附录 B B （规范性附录）（规范性附录）引物引物 表 B.1 列出了引物名称和序列。表表 B.1 引物名称和序列引物名称和序列 引物名称 引物序列 羊痘病毒检测上游引物(F)5-CAAAAGAGGAGGAAACGA-3 羊痘病毒检测下游引物(R)5-ATTGATCAGGGAATGGAC-3 羊痘病毒检测探针引物(P)5-HEX-TAAAACCAGCAGCATCTAGT-BHQ1-3 注：注：引物由生物公司合成，用水溶解并稀释至 100 mol/L 后，-20 保存备用；根据需要配制 10 mol/L 工作液，-20 保存供检测使用。6 全国团体标准信息平台T/SAIA 0052021 附录附录 C C （规范性附录）（规范性附录）荧光荧光 PCRPCR 反应体系配反应体系配制制 表 C.1 列出了所配制的反应体系。表表 C.1C.1 荧光荧光 PCRPCR 反应体系反应体系 试剂 1个检测反应的加入量 2X Pro Taq HS Probe Premix 10L 羊痘病毒检测上游引物(F)1 L 羊痘病毒检测下游引物(R)1 L 羊痘病毒检测探针引物(P)1L 检测样品 DNA 溶液 2uL 水 5L 总体积 20L 7 全国团体标准信息平台